课程PPT（药物鉴别方法）

实验九  薄层色谱法对药品的分析

薄层色谱分离原理

薄层色谱法（TLC）和纸色谱法（PC）都属于平面色谱法。薄层色谱法是用载板，如玻璃、金属或塑料薄片，上涂布或烧结一薄层物质作为固定相的液相色谱法。采用不同的固定相，可以进行吸附、分配、离子交换和分子排列色谱分离。应用最多的是以硅胶为固定相的吸附薄层色谱法。纸色谱法是以纸作为载体的色谱法，分离机制是分配色谱法。

薄层色谱的操作方法是取一块涂布有固定相（例如硅胶）的细颗粒层（厚约0.25mm）的薄层板。把样品溶液点在薄层的一端离边缘一定跟离处，将板置于层析缸中，使点有试样的一端浸入展开剂（流动相）中，由于薄层的毛细管作用，展开剂沿着薄层渐渐上升，试样中的各组分沿着薄层在固定相和流动相之间不断发生溶解、吸附、再溶解、再吸附过程。由于分配系数不同各组分在薄层上移动的距离不同，从而达到分离。展开剂上升到一定距离时，将薄层板从层析缸中取出。如果组分是有色的，就可以看到各个色斑，如果组分无色，要用物理或化学的方法显色，得到一个薄层色潜图。图是单个组分的薄层色谱图。

图中原点是滴加试样的中心点，斑点是组分在展开和显色后呈现的近似圆形或椭圆形的色区。原点至溶质斑点中心之间的距离（d_s）称为溶质迁移距离；原点至流动相前沿之间的距离（dm）称为流动相迁移距离用比移值（R_f）表示斑点的位置。

比移值（R_f）为溶质迁移距离与流动相迁移距离的比值：

影响R_f的因素主要有：溶质和展开剂的性质，固定相的性质、温度、展开方式和展开距离等。只有在完全相同的条件下，R_f对于某一组分才是常数。因此常用相对比移值R_f，来定性。相对比移值为组分与参比物质比移值之比。

在分析试样时，将试样与参考物质同时展开，可以消除一些系统误差。

薄层色谱操作方法

薄层色谱的实验步骤有：点样、展开、定位（显色）、定性和定量。下面分别介绍。

1.薄层板的制备

可以购买的预制板（有普通薄层板及高效薄层板），也可以自行制备。制备方法是：将玻璃板裁成正方形或长方形，分析用为500px×500px和250px×500px；预试用为75px×250px和65px×190px（显微镜用载玻片）。将玻璃片洗净烘干。铺层方法有干法和湿法两种，现常用湿法，因为它具有薄层牢固、可批量制备、展开后便于保存、分离效果好等优点。

选用粒径为0.048~0.058mm（250~300目）的硅胶，加入羧甲基纤维素钠（CMC）或煅石膏（CaSO₄•1/2H₂O）为粘合剂（市售硅胶G是已加了12%~14%煅石膏的硅胶），加入约3倍体积的水，调成糊状，倾倒在玻璃板上，轻轻颤动玻璃板，调好的硅胶自动淌成均匀薄层。也可用涂铺器铺层。根据用途薄层厚度可不同，一般分析用约为0.25mm，制备用约为1~3mm。涂铺好的薄层板在室温下晾干后，根据活性要求在一定温度下加热活化后存于干燥器中备用。

2.点样

将样品制成溶液（溶剂最好选择与展开剂极性相似且易于挥发的有机溶剂），浓度约0.5~2mg/mL。点样量为0.5~5μL，在距底边25px处点样，原点直径在3~4mm。手工点样用毛细管或微量注射器，如用点样仪点样，样量精确，形状整齐一致，能提高定量分析的准确度。

点样量与薄层性能、厚度及显色灵敏度有关，可根据需要来具体确定。点样量太小，斑点不能显示，点样量太大，影响比移值和斑点形状。

3.展开

展开的实验操作是将点样后的薄层板置于密闭的层析槽中，下端浸入展开剂，高度不应超过12.5px。展开距离一般为10~375px。根据溶剂移动的方向分为上行展开和下行展开。图（a）是一种近水平上行展开槽。图（b）是一种双底展开槽，节省溶剂且可方便地在另一底层中放展开剂或其他试剂，其蒸气可预饱和薄层板。

图 薄层展开图

另外，还可利用多次展开、双向展开等方法得到不同层析结果。

4.定位与显色

确定被分离组分的位置称为定位。展开后的簿层板自槽中取出，室温下挥发去溶剂。若被分离组分本身有颜色，它们的位置可根据有色的斑点即可确定。无色的化合物可采用物理检出法、化学检出法、酶与生物检出法和放射检出法来定位。

（1）物理检出法

物理检出法属于非破坏性检出法，常用的有：

①紫外光。有的化合物能吸收紫外光同时发出更长波长的光即荧光，可用此荧光定位。另一种方法是荧光消退技术，用有荧光剂的薄层板进行展开，于254nm或365nm荧光灯下观察，在波长230~390nm有吸收的化合物，在绿色的荧光背景上显暗紫色斑点。如化合物的紫外吸收较弱则检出不灵敏。

②碘。多数有机化合物能吸附碘，使斑点呈淡黄色或褐色。此反应一般可逆，碘挥发后，组分又回到原来的状态。此法可在密闭容器中放几粒碘晶体或喷雾0.5%碘的三氯甲烷溶液。

③水。憎水化合物在硅胶薄层展开后，可用水喷雾，对光观察显示白色不透明的斑点。

（2）化学检出法。

表9-1  部分通用显色剂

化学检出法是一种或数种化学试剂与被检出物质反应，生成有色化合物而定位。这种试剂叫显色剂。显色剂分为通用显色剂和专属显色剂。表2-3-4列出了部分通用显色剂，显色方式有喷雾法和浸渍法（必须硬板）。

5.定性

①与已知的标准品在同一块薄层板上进行对照，若R_f值相同，可能为同一化合物。还需用几个薄层层析系统比较，组分与标准品的R_f值均一致，一般可认为是同一化合物。

②试样斑点与标准品的显色特性相同可帮助鉴定。

③斑点用光密度计原位扫描，得到吸收光谱或荧光光谱可用于定性。

④收集斑点，洗脱组分，用紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振等方法鉴定。

检验原理和操作规程

1.薄层板制备：将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2~0.3mm），取下涂好薄层的玻璃板，置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30分钟。即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。

2.试样制备：取供试品适量（约相当于阿莫西林0.125g），用4.6%碳酸氢钠溶液溶解并稀释制成每1mL中约含阿莫西林10mg的溶液，作为供试品溶液；取阿莫西林对照品适量，用4.6%碳酸氢钠溶液溶解并稀释制成每1mL中约含阿莫西林10mg的溶液，作为对照品溶液。

3.点样：吸取上述溶液3μL分别点于同一块硅胶GF₂₅₄薄层板上，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边50px，点样直径为2~4mm，点间距离约为1.5~50px，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。

4.展开：展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂（乙酸乙酯:乙醚:二氯甲烷:甲酸=5:4:5:4），盖上展开室顶盖约20min，使系统平衡。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5~25px（切勿将样点浸入展开剂中），盖上展开室顶盖，等展开至规定距离（一般为10~375px），取出薄层板，晾干，置于紫外灯254nm下检视，与标准品对照，进行定性。供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。

数据记录和处理

表9-2  阿莫西林定性分析

任务点  视频---薄层色谱法操作技术