蚕豆根尖微核检测技术-1

蚕豆根尖微核检测技术-2

蚕豆根尖微核检测技术-3

                          实训   蚕豆根尖微核检测试验讲义

蚕豆根尖微核技术是由 Francesca 和 MaTe—Hsiu1982年建立的。 近年来，国内有人用蚕豆根尖微核技术来监测空气和水中的污染物，结果表明，微核率在不同污染时间及不同浓度下，均与对照组有显著差异，因此可作为监测环境污染的手段。 

一、 蚕豆根尖微核技术的原理

蚕豆根尖细胞在进行有丝分裂的过程中，染色体经常发生断裂，但一般情况下，断裂可以自行愈合，如果受到有害因子的攻击，染色体就不能愈合，甚至增加断裂，形成染色体片段，这些染色体片段由于缺乏着丝点而不能到达细胞的两极，而留在细胞质中，一旦新细胞核形成，这些片段就形成大小不同的小核，即微核。因此，可以根据微核率的高低说明诱变物的强弱。

二、受试生物材料

推荐的蚕豆品种为松滋青皮豆，是筛选出的较为敏感的品种。可采用直接购买或引种栽培繁殖的方法。

引种松滋青皮豆时，注意不要与其他蚕豆品种混，不施用农药和化肥，以保持其较低的本底微核值。种于成熟晒干后，为保证其发芽率，应贮于干燥器内，或用牛皮纸袋装好后，放入4℃冰箱内保存备用。 

如需对区域性水环境进行监测，也可用其他蚕豆品种。但应注意来源稳定、可靠，同时往意经常检查其敏感性，以保证监测数据的历史连续性和可比性。

 三、试验步骤 

1.蚕豆浸种催根

（1）选种 按照每一试样约需 50粒松滋青皮豆的数量，挑选颗粒饱满、豆皮青绿或青棕色、大小一致、无病虫害、表面无明显缺损的豆种，用水洗净。

 (2)浸种 按照每1000mL烧杯中最多300粒豆种的数量浸种，在烧杯中加调温水过 1000ml刻度，于恒温培养箱中25℃±1℃避光浸泡至豆种充分吸 胀。浸种约需26~30h,可在 18h和 24h时换水，若水出现浑浊，则增加换水频次。

 (3)催根 将医用纱布浸洗3次后拧干，叠4层 垫入洁净的搪瓷盘内，加少量调温水至纱布充分润湿。调温水用量以倾斜搪瓷盘，在最低处见少量溢水为宜。豆种用调温水漂洗后，均匀排布于搪瓷盘内，覆盖2层充分润湿的纱布，纱布含水量以悬挂时刚 好无水下滴为宜。盖上搪瓷盘盖，于25℃±1℃恒温培养箱中避光催 根62~66h。 

催根期间，每日检查2次，注意及时补水保持纱布处于刚被充分润湿的状态，随时除去不出根、霉变、根尖枯死、根尖形态或颜色异常的豆种，如下垫纱布出现黏性分泌物，需及时清洗更换。  

2.根尖处理 

挑选初生根长1.5~50px且生长发育良好的豆种，在每个根尖 处埋皿中插入10~12粒豆种，确保根尖没入试样至少25px，于 25℃±1℃恒温培养箱中避光放置6h。

 3.根尖细胞恢复培养 

取出豆种，用调温水浸洗3次，每次 5min，按照规定的条件恢复培养24h。

处理过程中，根尖如出现相关的急性毒性症状，则按要求增加试样急性毒性预试验；否则，直接进行后续试验。

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2.根尖处理 

挑选初生根长1.5~50px且生长发育良好的豆种，在每个根尖 处埋皿中插入10~12粒豆种，确保根尖没入试样至少25px（把发芽的蚕豆浸泡在待测液里就可以，芽要泡里面哦），于 25℃±1℃恒温培养箱中避光放置6h（12日7:20-13:20）。

 3.根尖细胞恢复培养 

取出豆种，用调温水浸洗3次，每次 5min（12日13:20-14:00之间进行），按照规定的条件恢复培养24h（12日14:00-13日14:00）。

处理过程中，根尖如出现相关的急性毒性症状，则按要求增加试样急性毒性预试验；否则，直接进行后续试验。

4. 根尖细胞的固定（13日下午14:00到实训室进行）

说明：各位同学判断下自己的蚕豆芽到12日早上长度会不会超过2厘米？如果超过就11日进行上述试验（对应时间加减即可），约下老师周一上午就到实训室进行蚕豆根尖固定。

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4.根尖细胞的固定

借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速透入组织和细胞使其停止生长，并且使其结构和内含物如：蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不易看清的结构。

固定时在 10ml 试管内放入卡诺氏固定液（冰醋酸：乙醇 1：3）约5毫升，用刀片或小剪刀切取经过处理的长约1厘米左右的根尖2条，置于具盖指管内（同一试样外理的根尖放入一个指管），加卡诺氏液后用塞盖紧，在室温下固定2h。固定时间最长不超过24h。固定液的用量为材料体积的15倍以上。

经过固定的材料如不能及时染色制片，则弃去卡诺氏液，用实验用水（95%乙醇或无水乙醇）洗净乙酸，加入70%乙醇溶液浸没，0—4℃保存不超过2个月，最好72h内染色镜检。 再观察时换用固定液再处理一次，效果较好。 

5-1.改良苯酚品红染色

（1）水解分离

水解分离的作用是去除未固定的蛋白质 , 同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。

取固定好的根尖，蒸馏水浸洗2次，每次5min。

吸净残水，用5M HCl 将幼根浸泡，连瓶放入28度水浴锅中水解幼根25min左右，至幼根被软化即可。

用蒸馏水浸洗幼根2次，每次5min，使材料呈白色微透明，以镊子柄能轻压碎好。

（2）染色

改良苯酚品红染色：切取根尖分身组织1-2mm，放在载玻片中央，用镊子或解剖针将材料轻轻捣碎。在暗室中滴加 1 — 2 滴染液， 8 —15 分钟后加上盖玻片，注意不要有气泡产生，用吸水纸吸去多余染液。

6.制片 

用镊子轻取染色效果良好的根尖，在滤纸上吸净表面水分，置于载玻片上，用手术刀截取1.0~2.0mm处的顶部根尖，滴加1滴乙酸分散液浸没根尖，手术刀充分捣碎，加盖玻片(避免产生气泡) 盖玻片上叠放滤纸，轻轻敲打以分散根尖组织，拇指按压制成薄片，使根尖细胞呈单层分散状。

压片 在盖玻片上面铺上滤纸，固定好盖玻片，用拇指垂直压片，均匀地敲打盖片，至肉眼见材料呈雾状即可，使细胞核染色体分散。

 7.镜检及统计 

将制备好的压片置于生物显微镜下，低倍镜下观察找出根尖细胞接近方形或椭圆形、分布均匀、不重叠的区域，转入高倍镜下镜检。 每一试样至少观察6个根尖，按判定规则对每个根尖进行以下统计：

 (1) 1000个细胞中处于有丝分裂期的细胞数;

 (2) 1000个处于有丝分裂间期细胞中的微核数。

显微镜下观察染色形态和计数，对典型分裂相细胞进行摄影记录。

低倍镜（ 10 倍）镜检后，选择细胞分散均匀，细胞无损，染色良好的区域（也可在高倍镜下观察），观察10个视野，每个处理观察 100 个细胞，记下微核数。

8.有丝分裂细胞及微核判定 

按照以下规则判定微核(图5—2，封二彩图) 

（1）大小为主核的1/3以下，且与主核分离或相切；

（2）着色反应和折光性与主核一致，内部有明显的染色质颗粒，色泽比主核稍浅或相当;

 (3)形态圆形、椭圆形或不规则。 

形态类似微核，但不符合上述特征，尤其是折光性与主核不一 致、内部无明显染色质颗粒、着色较深或过浅的颗粒即为伪微核 (图5—3，封二彩图)。

 四、质量保证与质量控制 

1.有丝分裂指数 

试样、空白试样、参比试样等处理后的所有进行镜检的根尖，每一根尖的细胞微核计数区有丝分裂指数应>20‰，否则该根尖微核计 数结果无效。

 2对照试验 

对照试验结果符合下列要求，试验结果方为有效。否则，查明原 因后重新进行试验。

 (1)阴性对照   根尖处理后，根尖不得有急性毒性症状，且 MCN空的≤实验室历史累积 MCN空白上限(参考值6.6‰)。 

(2)阳性对照   根尖处理后，根尖不得有急性毒性症状，且 MCN参比为23.3‰±7.5‰,即15. 8‰~30.8‰。

五、废物处理 

实验中产生的具有急性毒性或致突变性的废物按危险废物，其他按一般废物，分类集中收集，并做好相应标识，委托有资质单位进行处理。

六、结果计算与表示 

1.结果计算 

(1)每一根尖有丝分裂指数按式下式计算:

                 微核率(MCN‰) = (含微核的细胞数 / 检查的所有细胞数)*1000

       污染指数(IP ) = 样品实测MCN‰平均值 / 对照蒸馏水MCN ‰平均值。

其中：污染指数在 0一1.5 区间为基本没有污染；1.5一2区间为轻度污染 ；2一3.5区间为中度污染；3.5以上为重度污染。

实验报告：蚕豆根尖微核监测实验报告（空表）