一、荧光定量PCR概述

1、荧光定量PCR概念所谓定量PCR技术（real-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法（图1）。

图1 荧光定量PCR反应原理

2、荧光定量PCR与普通PCR的主要区别

常规PCR中，PCR产物通过凝胶电泳，然后进行成像分析，常规PCR只能通过终点法对扩增产物进行定性分析，而不能进行定量分析；荧光定量PCR中，PCR反应体系中加入了荧光分子，通过荧光信号的变化来反应扩增产物的变化，使PCR产物的实时检测成为可能。相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点使准确地确定初始模版拷贝数和较高的检测灵敏度；荧光定量PCR不仅可用于定性，如判断一段序列的有无，也可用于定量，如确定起始模版的拷贝数。

3、实时荧光定量PCR仪组成

实时荧光定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光，与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示，原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表，原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。

荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管。

4、荧光定量PCR的几个基本概念

4.1扩增曲线

描述PCR动态进程的曲线即扩增曲线。PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线（图2）。图2中，X－轴表示PCR循环数，Y－轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。

图2 荧光定量PCR扩增曲线示意图

4.2荧光阈值

一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值（threshold）的设定：一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 3~15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。

图3 手工调整荧光阈值示意图

4.3 Ct值

C代表Cycle，t代表threshold，所谓Ct值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。

4.4 标准曲线

在绝对定量中，未知样本的量如基因拷贝数可通过梯度稀释的已知量的标准品的Ct值推算出。在实验过程中，我们可以将已知浓度的标准品进行梯度稀释（5~6个稀释梯度），将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR实验中进行反应，将稀释标准品得到的Ct值构建标准曲线，通过标准曲线可以推算出未知样品的量（图4）。标准曲线的制作不需要人工操作，由仪器自动完成。

图4 荧光定量PCR标准曲线示意图