实时荧光定量PCR基本原理

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。

1、非特异性SYBRGreen I染料法

SYBRGreen I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料（图5），在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强（图6）。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

图5 SYBR Green I与DNA双螺旋小沟区域结合示意图

图6 SYBR Green I作用机理示意图

SYBRGreen I的优点：实验设计简单，仅需要设计上下游一对引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可快速检验多个基因，通用性好；成本低；能够通过溶解曲线分析检验扩增产物的特异性。在低通量实验和单重实验时一般优先考虑使用SYBR Green I染料法。

SYBRGreen I的缺点：由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性，SYBR Green I方法对PCR扩增特异性要求较高。

2、特异性Taqman水解探针法

Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从而实现定量。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生（图7）。随着扩增产物的增加，荧光增强。

图7 Taqman 探针工作原理

由于Taqman探针法中，除引物外，还使用了一条特异的探针，因此此方法可以特异的检测目标序列，防止非特异产物的干扰影响定量的准确性，同时它也可以用于多重反应，但探针设计成本较高，有时探针设计困难。