实时荧光定量PCR实验方法
绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。
举例来说：
1）测定未知样品的绝对量：如给定的血样中的病毒颗粒数，食品中某一种转基因成分的含量，就需要用绝对定量。
2）未知样品与已知样品相比，基因的表达量改变了多少倍：如相当量的肿瘤组织和正常组织相比，p53mRNA改变了多少倍，就需要用相对定量。
绝对定量是通过样品的Ct值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。相对定量的分析结果是在相当量的试验组（样品A）和对照组（样品B）中一个靶基因的相对比率（倍数差异）。
一、绝对定量分析实验流程
1、引物和探针的设计使用Taqman探针法要同时考虑探针和引物的质量。首先要寻找合适的探针位置，再设计引物，并使引物尽可能靠近探针。
2、标准品的制作：
2.1标准品制作流程
2.2标准品拷贝数的计算
待测样本浓度（ng/μL）＝OD260×40×稀释倍数
样本分子量=碱基数×324
待测样本拷贝数（copies/μL）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
2.3标准品的梯度稀释
3、荧光定量PCR模板的制备
RNA提取、逆转录
4、荧光定量PCR体系准备
PCR条件摸索：模板浓度、引物的浓度、探针浓度
5、荧光定量PCR体系配制及仪器程序设置
请参照各公司荧光定量PCR试剂、荧光定量PCR仪器说明书进行。
6、实验结果与数据处理
未知样品Ct代入标准曲线，确定拷贝数。
二、相对定量分析
相对定量分析方法
相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。
1、引物的设计
设计扩增片段长度时，最好在100－200bp范围内，在这范围内，扩增片段越短，有效扩增反应越容易实现，同时较短的扩增片段也可保证分析的一致性。
2、模板的制备
参考DNA/RNA提取、逆转录的相关资料。
3、PCR体系准备
PCR条件摸索：同绝对定量分析条件摸索，只是值得注意的是由于SYBR染料法对引物要求要比探针法高，在荧光定量实验前，我们可通过普通PCR实验来评价引物质量。
4、荧光定量PCR体系配制及仪器程序设置
请参照各公司荧光定量PCR试剂、荧光定量PCR仪器说明书进行。
5、实验结果与数据处理
5.1 2-ΔΔ Ct法：
成立条件：假设扩增效率为100%
满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近；2）内参基因和目标基因的扩增效率均为90%-110%。
假设条件：内参基因和目标基因扩增效率差异大于5%；
1）优化实验条件，使扩增效率接近；
2）使用其他方法
5.2 双标准曲线法
假设条件：内参基因和目标基因扩增效率不同。
优点：实验优化简单；
缺点：每一轮实验都必需做标准曲线。
