细胞死亡的12种方式

什么是细胞凋亡？

细胞凋亡是由基因控制的,自主的、有序性的死亡, 是受一套程序严密控制的过程,又被称为细胞程序性死亡（ programmed cell death，PCD）。

*细胞坏死是细胞在遭受极度刺激时引起的细胞死亡，以细胞质膜的破裂为特征，造成内含物的炎性泄露，是一种非正常死亡。

什么是细胞焦亡？

细胞焦亡（pyroptosis）主要在炎症性细胞死亡中被发现，早期一直被认为是凋亡过程，近年已解析感染或损伤性信号活化焦亡的下游通路。

GSDMD是Gasdermin家族成员，是焦亡的核心效应分子。目前认为GSDMD主要受Caspase-1/4/5/11活化可以在276位Asp进行切割产生活性。近期也有关于其功能的新研究。在中性粒细胞中，GSDMD可以经弹性蛋白酶Elastase水解，介导中性粒细胞发生焦亡。在凋亡通路活化后，GSDMD可经Caspase-3在88位Lys位点发生切割，此时其N端具有活性功能的结构域破坏，丧失了诱导焦亡的功能。而有一些研究也曾发现Caspase-8可参与相关感染免疫通路的调控，但具体机制仍不清。

近日，Science和PNAS杂志相继发表了对耶尔森氏菌Yersina感染引起细胞死亡研究的新成果，分别为马萨诸塞大学医学院的Egil Lien和Katherine A. Fitzgerald课题组发表于Science题为Pathogen blockade of TAK1 triggers caspase-8–dependent cleavage of gasdermin D and cell death和塔夫茨大学医学院Alexander Poltorak发表于PNAS题为Caspase-8 induces cleavage of gasdermin D to elicit pyroptosis during Yersinia infection的研究。这两篇文章共同发现耶尔森菌Yersinia感染巨噬细胞后，毒力蛋白YopJ通过抑制TAK1（TGFβ-activated kinase）活性活化了RIP1和Caspase-8。Caspase-8可通过切割GSDMD为活性形式引发焦亡。这两篇研究破除了既往对耶尔森菌引起巨噬细胞凋亡的错误认识，并赋予了凋亡Caspase-8参与焦亡过程的新功能。

两篇文章均发现，在野生型Yersinia感染可以诱导细胞死亡，并可伴有Caspase-8及下游其他Caspase的活化，而YopJ缺失的突变株则无此效应。在使用LPS+5z7（TAK1抑制剂）处理模拟野生型Yersinia感染同样可见检测到细胞死亡增加。Rip3-/-Casp8-/-小鼠BMDM对野生型Yersinia感染和LPS+5z7处理呈现不敏感，而Casp1/Casp11-/-小鼠BMDM仍表现为敏感。在感染过程中，免疫印迹实验可看到Caspase-8发生了活化，并且其下游其他凋亡Caspase（Caspase-3/7）和炎症性Caspase（Caspase-1）也发生一定程度活化。Science文在设置感染后时间点，证实Caspase-8活化优先于GSDMD活化，最后才为Caspase-1活化。二文同样观察到野生型Yersinia感染引起巨噬细胞更多呈现焦亡的形态学特征，PNAS文在此处使用时间间隔显微镜摄影，并用PI和Annexin V染色清晰的展示了该型死亡与常规的凋亡和坏死性的差异。

2018年NCCD将焦亡修正为：一种依赖于gasdermin家族蛋白形成质膜膜孔的可调控的细胞死亡（Regulated cell death），经常但并不总因炎症性Caspase的活化而完成（A type of RCD that critically depends on the formation of plasma membrane pores by members of the gasdermin protein family, often (but not always) as a consequence of inflammatory caspase activation.）

实验目的

了解细胞凋亡的原理

掌握离体诱导凋亡的方法

掌握用普通光学显微镜和荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学变化

掌握实验论文写作的方法

细胞凋亡形态的光学显微镜和荧光显微镜检测

利用普通细胞核核染料

利用细胞核荧光染料

利用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术

流式细胞仪检测细胞凋亡

常用的凋亡试剂盒除了采用Annexin-V标记之外，还会加一种DNA染料，常用的有PI和7-AAD，由于死亡的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和DNA结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。

在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）与PS具有高度的结合力。被标记的Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外侧的磷脂酰丝氨酸。Annexin V标记，同时结合使用PI拒染法（坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI染料高度亲和）可以用流式细胞仪进行凋亡细胞双染后的检测。

细胞凋亡的生化特征：
①胞浆内Ca2+浓度升高。
②细胞内活性氧增多。
③质膜通透性增高。
④DNA内切酶被激活，双链DNA在核小体之间切断形成180~200bp的特征性的有序片断。
⑤Ⅱ型谷氨酰胺转移酶和钙蛋白酶（Calpain）活性升高。

细胞凋亡的生化改变
①DNA片断有规律的降解
②细胞凋亡另一生物特征是DNA发生核小体间的断裂，结果产生含有不同数目核小体单位的片断，在进行琼脂糖凝胶电泳时，形成了特征性的梯状条带(DNAladders)，其大小为180-200bp的整数倍； 而细胞坏死时，DNA随意断裂为长度不一的片断，琼脂糖凝胶电泳呈“弥散状”（smearladders）条带。

实验设计：

  分小组任选材料，设计诱导凋亡条件。

1、 利用离子胁迫（钾、钠、钙）诱导洋葱细胞凋亡

2、  选择氯化钠、氯化钾、氯化钙为诱导剂，设置不同浓度（5,10,15，20M），分别处理洋葱鳞茎内表皮2、4、6、8、10、15、20min，

分别滴加适量普通染料和荧光染料染色，观察细胞凋亡情况，并进行凋亡细胞的形态学描述。

3、 无机盐胁迫诱导鸡血细胞凋亡

以终浓度为5、10、15、20、25M的NH4NO3 分别处理鸡红细胞2、4、6、8、10、15、20min，观察细胞凋亡情况，并进行凋亡细胞的形态学描述。

实验论文基本要求：

根据课程的实验记录，选择一种材料进行细胞凋亡诱导，对实验结果系统的撰写一篇课程论文。论文字数不少于2000字；参考文献不少于12篇；文字流畅，逻辑性强，应用科学语言进行写作，避免口语化描述；对于所涉及的科学概念与术语力求准确、严谨；系统分析实验数据，应用分析软件，对不同诱导方法及浓度等差异性做显著性分析。论文格式按理科学术论文发表格式撰写。