-
1
-
2
转基因动物（transgenic animal）是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，使之具有新的稳定遗传性状的动物。
它是在胚胎学和重组技术发展的基础上产生的，是实验动物学和分子生物学紧密结合的成果。1982年，Palmiter获得世界上第一只转基因动物“超级鼠”，实现了哺乳动物间遗传物质的交换和重组。1997年，英国罗斯林研究所克隆羊“多莉”的诞生，突破了有性生殖的框架，表明高等动物也可以由无性生殖来繁殖。从此，转基因动物技术迅速发展，随着转基因小鼠、兔、猪、羊和牛等的相继问世，此后，转基因动物研究在全世界范围内形成一个前所未有的高潮（表1）。转基因动物技术能够使研究者通过人为的方法对动物基因组进行操作，并在RNA、蛋白质等分子水平和形态、生理等整体水平直接观察基因对动物活体的影响，是一个多维的研究体系。转基因动物技术已成为当今生命科学研究中一个发展最快、最有前途的领域。
转基因动物的基本操作过程
转基因动物培育是借助分子生物学和动物胚胎工程的技术。从理论上讲，培育转基因动物的步骤主要表现为以下几个方面：（1）外源目的基因的分离；（2）外源目的基因与带有特异性启动子、增强子、报告基因等元件的载体拼接重组；（3）含有目的目的基因的重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞；（4）胚胎移植技术（embryotransfer）；（5）转基因胚胎的发育、生长及后代转基因个体的鉴定与筛选；（6）目的记忆整合效率和表达效率的检测；（7）利用表达外源基因的转基因动物体为种畜或种禽而培育新的纯合系。
转基因动物
转基因动物（transgenic animal）是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，使之具有新的稳定遗传性状的动物。它是在胚胎学和重组技术发展的基础上产生的，是实验动物学和分子生物学紧密结合的成果。1982年，Palmiter获得世界上第一只转基因动物“超级鼠”，实现了哺乳动物间遗传物质的交换和重组。1997年，英国罗斯林研究所克隆羊“多莉”的诞生，突破了有性生殖的框架，表明高等动物也可以由无性生殖来繁殖。从此，转基因动物技术迅速发展，随着转基因小鼠、兔、猪、羊和牛等的相继问世，此后，转基因动物研究在全世界范围内形成一个前所未有的高潮（表8-2）。转基因动物技术能够使研究者通过人为的方法对动物基因组进行操作，并在RNA、蛋白质等分子水平和形态、生理等整体水平直接观察基因对动物活体的影响，是一个多维的研究体系。转基因动物技术已成为当今生命科学研究中一个发展最快、最有前途的领域。
转基因动物的基本操作过程
转基因动物培育是借助分子生物学和动物胚胎工程的技术。从理论上讲，培育转基因动物的步骤主要表现为以下几个方面：（1）外源目的基因的分离；（2）外源目的基因与带有特异性启动子、增强子、报告基因等元件的载体拼接重组；（3）含有目的目的基因的重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞；（4）胚胎移植技术（embryo transfer）；（5）转基因胚胎的发育、生长及后代转基因个体的鉴定与筛选；（6）目的记忆整合效率和表达效率的检测；（7）利用表达外源基因的转基因动物体为种畜或种禽而培育新的纯合系。
转基因动物的制备技术
转基因动物的制备技术是在经典遗传学、分子遗传学和DNA重组技术等的基础上，运用基因工程手段，将外源目的基因导入动物细胞（受精卵或早期胚胎细胞）中，使之整合到宿主细胞基因组内，并稳定地遗传给下一代的生物技术。利用传统的转基因方法，如显微注射法、精子载体介导法和脂质体介导法等，已制备了转基因小鼠、牛、羊和鸡等动物。近年来，动物转基因技术在其多样性和实用性方面取得了显著的进步，尤其是生殖干细胞介导的转基因技术、RNA干扰介导的基因沉默技术和诱导多能干细胞（iPS）技术的发展，使转基因动物基因表达的精确调控称为现实，且动物制备效率明显提高。将来更多更新颖的转基因技术的出现，将解决现在技术存在的弊端，使得转基因动物具有更加广阔的应用前景。
外源基因导入动物细胞的方法
根据外源基因导入的方法和对象的不同，转基因动物的制备方法主要包括显微注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、体细胞移植法、精子载体介导法。
显微注射法
显微注射法是将外源DNA在显微操作系统的辅助下，通过玻璃微管直接将外源DNA注入动物受精卵的原核内，使外源基因整合到基因组上，制备转基因动物。以小鼠为例，显微注射法的主要实验程序如下：
1) 准备假孕母鼠(养母)：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母；
2) 受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素(HCG)促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用；
3) 基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内；
4) 胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟；
5) 对幼鼠的鉴定：①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠(founder)；②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；③自小鼠内脏提取RNA，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验(ELISA)或放射免疫测定(RIA)等。亦可取胚胎进行分析。中国已有少数实验室(如中国医学科学院基础医学研究所)应用此法进行载脂蛋白TGM研究。
显微注射法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直接转移目的基因，目的基因的长度可达100kb。它可以直接获得纯系，所以实验周期短。但需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。
以小鼠受精卵雄原核的显微注射为例，显微注射所使用的受精卵固定吸管（holdingpi-pette）及注射针（injectionneedle）制备很困难，除影响操作时间外，也是影响转基因效率及基因注入后之胚胎存活及转基因成功与否极其重要的因子。固定吸管之内、外径分别为30、80μm是较为合适的，显微注射针自针尖起20μm处的外径为4μm时，可获得良好的转染效率。固定吸管的内径如果太小，会导致吸力不足，对受精卵操控不易；如太大，则受精卵易受伤害，影响胚胎的存活率。
显微注射针尖如果太粗，则导致插入透明带及原核的阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解；太细则导致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，而使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。因此进行受精卵雄原核的显微注射时，如何制备适用固定受精卵的吸管及显微注射针是关乎转基因效率极其重要的因素。
反转录病毒感染法
反转录病毒具有高效感染宿主细胞并可高度整合DNA的特性。以反转录病毒作为载体，把带有外源基因的反转录病毒载体DNA包装成高滴度病毒颗粒，感染发育早期的胚胎，将外源基因导入宿主染色体的方法称为反转录病毒感染法。感染胚胎后，将感染的桑葚期胚胎细胞导入子宫，可发育成携带外源基因的子代动物。
反转录病毒感染法的主要过程如下：
1) 反转录病毒载体的构建。将反转录病毒的反式作用序列、编码病毒的包装蛋白的基因切割下来，构建成反转录病毒载体，将外源基因取代反转录病毒的顺式作用序列构建成重组病毒DNA。通常将禽类和鼠类的反转录病毒作为载体。
2) 选择和培养包装细胞系。将切割下来的反式作用序列转入特定选择的细胞，整合到特定细胞的染色体上构成包装细胞。它能为反转录病毒载体提供包装蛋白，决定着重组病毒效价及其宿主范围。包装蛋白基因无需自己构建，可购买。
3) 重组反转录病毒导入包装细胞。载体转染包装细胞后，将载体DNA转录的RNA和包装细胞表达的病毒蛋白包装成具有感染性的重组颗粒。
4) 收获病毒颗粒，用于转染早期胚胎。
5) 细胞中转化。将重组病毒颗粒感染靶细胞，使细胞转化。
目前，反转录病毒载体培育的转基因呢动物主要是小鼠和家禽，是制备转基因鸡最有效和最成功的方法。此方法的优点是操作简单，重组反转录病毒可同时感染大量胚胎，感染后的整合率高，外源DNA在受体细胞基因组中的整合通常是单拷贝的，不需要昂贵的仪器。不足之处是由于选用的受体是早起胚胎，不是受精卵，致使外源DNA在动物各种组中中的分布不均匀，不易整合到生殖细胞中；病毒衣壳的大小有限制，目的基因不宜超过10kb，否则影响细胞活性和稳定性，而且被导入的外源DNA的大小一般不超过15kb，否则很难整合到胚胎细胞中。
精子载体介导法
精子载体介导法是将外源基因与精子共培养，将外源基因导入成熟的精子，进而将外源基因导入受精卵中，使外源基因整合到动物染色体中。这种转基因动物的产生可以通过体外受精或人工受精完成。外源DNA导入精细胞的方法有外源DNA与精子共育法、体外电穿孔法和脂质介导法。目前利用该方法已获得了转基因小鼠、大鼠、鲑鱼、鸡和牛等。
精子载体介导法操作简单方便、成本低、效率高，对卵原核无损害，几乎可以在所有动物上应用，这为医学、药物学、畜牧业等领域提供了一条新的基因转移途径。该方法的不足之处为精子携带DNA的条件难以掌握，实验结果不稳定，可重复性差。
胚胎干细胞法成
胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)是指从哺乳动物囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的潜能性，能够分化出各种组织。体外培养ES细胞，利用基因转移技术将外源DNA转入ES细胞，经体外培养、筛选和鉴定，将所获得的ES细胞经过囊胚腔注射等与受体囊胚细胞混合，并植入假孕母体子宫继续发育产生嵌合体，再通过杂交成为纯合体。胚胎干细胞法的基因过程如下：
1) 获取发育至一定时期的胚胎，经培养后，剥离和分散内细胞团，再培养，最后分离、扩散、鉴定ES细胞。
2）通过基因打靶技术，将外源基因导入ES细胞，进行体外培养、筛选和鉴定。
3）获取囊胚期胚胎，作为ES细胞的移植受体。
4）通过显微操作将ES细胞注入到囊胚期胚胎的腔内，使之与内细胞团紧靠在一起，成为嵌合体。
5）将注射过的胚胎，经培养后筛选无发育缺损的囊胚，移植到交配第3天的假孕受体动物子宫内，培育出转基因动物。
胚胎干细胞法在细胞中实现遗传修饰，遗传修饰能力强且十分精确，外源基因整合率高，基因转移操作方便，但目前可用于该系统的ES细胞系只来源于小鼠，适合物种少。另外动物育种经过嵌合体途径，实验周期长。
体细胞核移植法
将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞（包括动物成体体细胞、胚体成纤维细胞等），以这些动物体细胞为核供体，通过显微操作或电融合使核供体与相应的核受体（去核的原核胚或成熟的卵母细胞）不经过有性繁殖过程，在体外直接进行重组融合，对重组的胚进行胚胎移植，进而得到带有外源基因的转基因动物，利用此技术科通过建立转基因体细胞的方式，制备转基因小鼠
1997年英国Roshilin研究所Wilmut等成功克隆出世界首例体细胞核移植的后代—克隆羊“多莉”，接着Gibelli（1998）通过该技术得到含有lacZ基因的转基因牛；Alexander（1999）获得的含有抗胰蛋白酶基因的转基因奶山羊。这一成果为培育转基因动物提供了新方法，是克隆技术领域研究的巨大突破。但目前体细胞核移植法成功率较低，技术不够完善，体细胞核移植过程中何知互作，体细胞核移植技术依旧存在一些问题，需要进一步对其完善。
转基因动物技术的新发展
生殖干细胞法
（1）精原干细胞法
精原干细胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是在哺乳动物的睾丸内一群像ES一样具有高度自我更新能力和分化潜能的细胞。精原干细胞位于雄性哺乳动物体内曲细精管生精上皮基膜内，不仅能够自我更新生成新的干细胞，而且可以源源不断的增殖分化形成各阶段的生殖细胞直至精子，从而向下一代传递遗传信息。该技术是将体外培养的适龄雄性供体动物的精原于细胞注入适龄受体动物的生精小管中，进而产生精子。此项技术为研究精子的发生以及转基因动物的制作提供了一个极佳的思路，因为在体外培养精原下细胞的过程中可以探索最佳的DNA转染条件，还能够对转染外源基因的阳性精原干细胞进行筛选，从而大大提高了转基因效率。如，Honaramooz等通过腺相关病毒(Denoa-ssociated virus，AAV)携带GFP报告基因转染体外培养的山羊精原干细胞，然后将其移植到射线照射处理过的受体山羊睾丸内，转染后的精原于细胞能够定植并生成精子。采精后进行体外受精，转基因胚胎阳性率可达10%。这是第一个成功通过精原干细胞移植的方法进行大家畜转基因研究的报道，为建立转基因大动物模型带来了希望。随着培养体系的不断完善，筛选、移植方法的不断改进，一定可以获得更高的移植成功率，提高生产转基因动物的效率等。
（2）原始生殖细胞法
原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)是指能够发育成为精子或卵子的祖先细胞，来源于胚胎生殖嵴，与来源于囊胚内细胞团(Inner cell mass)的胚胎于细胞同属全胚层多能干细胞(Pluripotent stem cells)。原始生殖细胞可以定居在受体性腺，并能够在受体胚胎性腺迁移、增殖。又由于各个时期的原始生殖细胞都可以作为转基因的受体细胞，故以其作为载体进行转基因研究较为简便、高效，并逐渐引起关注。如。Van de Lavoir等（2006年）将携带有绿色荧光蛋白基因的PGC注入孵化3d的鸡胚内，将孵化出的公鸡与未转入基因的母鸡交配，成功获得生殖腺转入外源基因并带有绿色荧光的雏鸡。利用原始生殖细胞进行转基因来制备转基因动物有很大的优势，其可操作性强，可以大量制备，是近几年发展起来的一项新的转基因技术。该方法同基因打靶技术相结合，可以同时提高转基因效率和精确度，在转基因动物研究中将会得到广泛的应用。但如何优化其操作以提高转基因效率以更好的应用于转基因家畜等问题还有待进一步的探索。
2）基因打靶技术
基因打靶技术（Gene targeting technoloyy)是指通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。它克服了随机整合的盲目性和危险性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因打靶技术包括：胚胎干细胞(ES细胞)基因打靶、体细胞基因打靶和条件性基因打靶。
（1）胚胎干细胞(ES细胞)基因打靶
胚胎干细胞(ES细胞)基因打靶，该方法利用ES细胞能在体外培养并保留发育的全能性，将改造后的外源基因导入ES细胞后，再把ES细胞注入动物囊胚.ES细胞能够参与宿主细胞的胚胎构成，形成嵌合体直至达到种系嵌合，从而将带有外源基因的ES细胞传给后代，产生转基因动物。如Bradly等首次成功地用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获得了源于ES细胞系的纯系小鼠。
该方法中，ES细胞提供了一个研究处理整体细胞群的实验体系，利用ES细胞作为载体，体外定向改造ES细胞，可使得基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平上进行。目前，在ES细胞中进行同源重组已成为一种对小鼠染色体组任意位点进行遗传修饰的常规技术，该技术可以应用在研究基因功能和疾病模型方面。但是，至今尚未获得家畜的ES细胞用于基因打靶，从而也限制了基因打靶在制备乳腺生物反应器等实际生产中的应用。
（2）体细胞基因打靶
在体细胞克隆技术成功之后，科学家们不再将基因打靶技术局限于ES细胞，而将基因打靶与体细胞核移植技术结合起来作为制备转基因动物的一种新的选择。首先设计合成一个将要导入体细胞的打靶载体，将此载体导入受体细胞，之后可以在体外培养条件下对整合外源基因的体细胞进行大量增殖和筛选，同时可以进行外源基因的表达分析，然后将整合并能高效表达外源基因的体细胞作为核供体，与核受体（一般是成熟卵母细胞）进行体外融合重构以形成克隆胚胎，再将克隆胚进行胚胎移植给代孕的母畜，从而诞生出某一基因发生定向改变的后代。如Baldassarre等（2008）报道，重组人丁酰胆碱酯酶(rBChE)在哺乳期山羊乳中的表达量可达到1～5g/L。
该技术绕过了需要ES细胞打靶的障碍，直接在体细胞中进行基因同源重组，体外筛选中靶细胞，通过核移植制备转基因动物。ES细胞经过打靶修饰、筛选、扩增后仍保持进入生殖系的能力，但体细胞不同，用于克隆家畜的体细胞体外存活时间是有限的，尽管有些细胞在经过基因打靶进入核移植时仍具有全能性，但衰老的细胞打靶效率会降低，这也成为体细胞基因打靶的主要限制因素。相信随着新技术的不断出现，靶受体细胞的培养传代、打靶以及核移植等相关技术会被攻破，从而提高体细胞基因打靶效率。由于该方法建立的转基因动物可高效表达体细胞中转入的外源基因，可以加快制备商业化生产水平的生物反应器及生产基因工程药物等的发展。
（3）条件性基因打靶
外源基因整合到动物基因组中带有随机性，表现为整合位点的随机性和拷贝数量的随机性，这使得转入目的基因的表达有很强的不可控性。而条件性基因打靶则是一个绝佳的策略，具有很大的应用价值。它主要是基于Cre/LoxP系统从而使打靶产生的变异在时间、空间或时空上都具有特异性，Gu等利用这种策略首先实现了DNA聚合酶β基因在T细胞的灭活。
该系统包括Cre重组酶和loxP位点两部分，其中LoxP由两个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域构成，Cre重组酶可识别LoxP位点，切除或置换两个LoxP位点间的DNA片段。因此可以通过给Cre重组酶1基因选择适当的组织特异性启动子，控制Cre重组酶基因在特定组织细胞中表达，保证基因表达的空间特异性。而Cre/LoxP系统通过两种方式保证了目的基因表达的时间可控性：一种是在Cre重组酶基因的上游置入诱导剂依赖性的启动子，如四环素调控蛋白启动子、干扰素诱导性启动子等，根据需要在不同的时间给予诱导剂，启动转录使Cre重组酶表达，从而调控基因表达；另一种是将Cre重组酶基因与类谷醇受体的配体结合域（Ligand binding dormain，LBD)基因结合，表达出的融合蛋白的重组酶活性需要在激素类诱导剂作用下才能被激活。
利用Cre/LoxP系统可以实现条件性基因敲除，即构建打靶载体时，在目的基因的两侧加上相同方向排列的LoxP序列，然后进行基因打靶制备转基因小鼠系。与此同时，再制备一种转入Cre重组酶基因的转基因小鼠，这两种小鼠交配后即可产生同时含有以上两套基因的转基因小鼠。将Cre重组酶基因与诱导型启动子或类固醇激素受体的LBD融合，并为其选择适当的组织特异性启动子，则可以在动物个体出生后根据时间需要激活Cre重组酶，切除基因组中两个loxP位点之间的基因，实现目的基因在某个特定组织器官的局部敲除。这一策略特别适用于研究一些胚胎期必需基因的功能和广泛表达的基因在某一特定组织中的功能。相反，利用Cre/LoxP系统还可以实现条件性基因修复，如将两个loxP位点插入到某个功能基因中，即可根据时间需要通过药物诱导激活Cre重组酶，切除两个loxP位点之间的片段使目的基因重新恢复功能。
Rendahl等首先将Cre/LoxP系统与胚胎干细胞的研究结合了起来。将Pgk-LoxP-Neo盒引入胚胎干细胞的目的基因座，Cre酶表达pgk启动子被除去，同时ES细胞对G418的敏感性增加。这项研究有效地将单拷贝基因引入确定的基因座，加强了内源性调控元件控制转入基因的表达。由于细胞对Cre酶的吸收有限，从而限制了Cre/LoxP系统的应用，改进细胞对其的吸收效率也是Cre/LoxP系统研究的一项重要内容。Chenuaud等研究了由Kaposi成纤维细胞生长因子改进的疏水肽。以及HIV-TAT的基本肽对细胞吸收Cre酶效率的影响。结果表明当核定位信号与Cre的融合物与TAT肽融合后使成纤维细胞、鼠胚胎干细胞对Cre的吸收增加到95%。
总之，该系统利用组织专一性启动子对转基因表达保证了空间专一性，同时利用药物诱导系统对转基因表达保证了时间可控性，实现了定时、定位地对外源目的基因进行精确调控，达到了人为控制其表达的目的。可以利用此技术建立时空表达可控的转基因模型调控体系，对基因功能的研究具有十分重要的价值。
3）RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默技术
RNA干扰(RNAi)是双链RNA介导的特异性基因表达沉默现象，利用该方法，可以部分地抑制特定内源基因的表达，或通过mRNA的降解使目的基因表达下调沉默，从而实现基因表达调控的时空性和可逆性。
双链小分子RNA(siRNA)可通过互补序列特异地结合目标mRNA，被结合的mRNA将不再翻译而使动物表现出特定的性状改变。例如，2005年Acosta等设计了斑马鱼myostatin基因的干扰片段并注入其受精卵，这段干扰片段即双链小分子RNA干扰了myostatin的表达并降低其mRNA水平，从而解除myostatin基因对肌肉组织生长和发育的抑制作用，产生肌肉发达的斑马鱼。
近几年已经开发出时空RNA干扰技术，通过控制干扰基因的转录，实现对RNA干扰的控制。2007年，Dickins等将启动子四环素反应元件(Tetracyclin response element，TRE)与RNA干扰基因结合后转入小鼠中，成功转入的小鼠再与转有转录因子(tTA)的小鼠杂交，制备出同时含有TRE、RNA干扰基因以及tTA的转基因小鼠。利用给予这些小鼠四环素药物，来激活tTA系统并使之与启动子结合，进而激活TRE，从而启动RNA干扰。
由于并不是所有的siRNA都能起到抑制效果，因此RNAi应用的重要问题是如何设计有效的RNAi序列，并使其在细胞内长时间稳定的表达。虽然RNAi现象的机制目前还没有完全弄清楚，涉及到很多不明功能的酶和蛋白质，但该技术有望被广泛用于基因功能分析和疾病治疗的研究中，推动分子生物学、医学等的进展。如利用RNAi可以降低或抑制某些基因的表达，建立相应的动物模型用于病毒性疾病治疗和预防，将会是一个具有广阔发展前景的领域。也可以将RNAi技术与其他转基因方法如体细胞克隆法相结合，定向地生产转基因动物用于研究与生产。
4）诱导多能干细胞转基因技术
诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS cells)是将几种转录因子转入已经分化的体细胞中，使其重编程为类似胚胎干细胞的一种细胞类型。iPS细胞的功能同ES细胞非常相似，具有多向分化的潜能。同普通细胞一样，iPS细胞能够作为转基因的靶细胞，可以通过一定的转基因技术将外源基因转入iPS细胞，也可以针对iPS细胞进行基因打靶或基因敲除等遗传修饰，从而根据人的意愿实现iPS细胞内基因改造，然后将其注入囊胚腔来获得嵌合体后代，高效、定向的生产转基因动物。另外，将iPS细胞应用到体细胞核移植技术是一个非常不错的选择，利用iPS细胞作为核供体细胞，同适当的受体细胞融合后便可以直接获得转基因动物。因此，在转基因动物研究中，将iPS细胞诱导技术同动物转基因技术相结合是一种创新，应用该方法不仅可以避免种间繁殖障碍，克服亲缘关系的制约，而且可获得用传统的交配方法无法得到的动物新性状。
与ES细胞相比，iPS细胞具有明显优势、其避免了分离ES细胞时对大量优质胚胎的破坏，而且iPS细胞容易获得，普通的体细胞即可诱导产生。另外，由于iPS细胞强大的可塑性，使基因的遗传修饰更加高效，转基因动物的制备也更加方便快捷。iPS细胞的应用在转基因动物生物反应器以及人源性疾病动物模型的制作等方面具有深远的意义。但是，目前这一技术刚刚起步，还有许多问题等待解决，例如如何提高iPS细胞的诱导效率，如何保持iPS细胞多能性，如何定向可控的诱导iPS细胞等。随着研究的不断深入，这些问题都会得到更好的解决，进一步促进动物转基因技术的发展。
8.2.4转基因动物的鉴定
转基因动物技术中，外源基因导入后是随机整合的效率很低。外源基因导入能否整合、能否正常表达，目前尚难控制和预测，培的育的子代动物是否为转基因动物，需要进行严格的筛选和鉴定。转基因动物的鉴定主要从4个方面进行：（1）染色体和基因水平，该水平主要检测子代动物基因组是否整合外源基因，以及整合位点和拷贝数。常用的方法为PCR、Southern和染色体原位杂交法等；（2）转录水平，该水平主要检测外源基因是否表达mRNA。常用的方法为RT-PCR、Northern和RNase保护分析等；（3）翻译水平，该水平主要检测外源基因是否表达出蛋白以及蛋白活性程度。采用Western、酶联免疫吸附法和质谱技术等检测外源基因是否表达；生物化学方法检测表达产物的生化性质和活性；（4）整体水平检测，转基因动物整体水平的检测包括：①从遗传学上对动物整体水平进行生物学特性研究，如生长速度、繁殖周期、生理生化指标和行为学研究等；②对转基因动物的器官、组织细胞的结构和功能方面的分析；③借助于先进的体视学仪器对转基因动物的器官、组织或细胞进行三维的无偏定量的形态进行分析。
转基因动物研究中出现的问题
技术性问题
1）转基因动物的效率低。转基因效率低是目前从事转基因动物研究的实验室面临的问题，同时也是制约该技术广泛应用的关键。以显微注射产生的转基因动物为例，统计资料表明，小鼠转基因的阳性率为2.6%，大鼠为4.4%，兔子为1.5%，牛为0.7%，猪为0.9%，绵羊为0.9%，造成这种现象的主要原因可能是与胚胎受到损伤有关。
2）转基因的行为难以控制。外源DNA引入受体细胞后可以随机地插入受体细胞基因组中的任意位置，容易导致内源有利基因结构的破坏和失活，或激活有害基因（如癌基因）。其结果将导致转基因阳性个体出现不孕、胚胎死亡、四肢畸形等异常。
3）转基因表达水平难以预料。大部分转基因表达水平很低，几乎难以检测到，但个别基因表达又过高。外源基因的高水平表达是宿主动物难以承受的。例如表达外源生长激素的转基因猪，长期处于较高生长激素的体内环境中，内分泌平衡遭到破坏，出现了多种病态，如胃溃疡，关节炎，心包炎，肾脏疾病，不育等，这使其寿命短，早死亡率高。
4）人们对动物许多重要基因的结构和功能尚不完全清楚，这使转基因动物研究进展受到了极大的阻碍。
理论问题
目前，转基因动物研究存在理论基础积累不足的问题，特别是对转基因过程中的精细理论及其过程不甚清楚；其次，转基因技术支撑体系不够完善，致使目前转基因动物的成功率和成活率极低，这是限制转基因动物发展的主要因素。
安全性问题
1）食品、药品安全性。对于转基因动物，有些外源基因及其启动子来自于病毒序列，有可能在受体动物体内发生同源重组或整合，形成新的病毒。外源基因在染色体内插入位点的不同也可能造成不同程度的基因改变，引起非预期效应。转基因动物还可能增加人畜共患病的风险，某些动物可能导致人类过敏性反应等
2）生态安全性。转基因动物在外界环境中与野生动物交配，导致外源基因扩散，改变了物种原有的基因组成，造成了物种资源的混乱。还有可能导致野生等位基因的丢失，从而导致遗传多样性的下降；转基因个体经过人工定向改造，往往抗逆抗病性强，对环境具有更强的适应性和竞争力，一旦释放到自然环境中，可能破坏原有的种群生态平衡，威胁物种的遗传多样性，例如转基因鱼一旦放入鱼塘或江河中便无法控制，影响水域生态平衡。
3）伦理性问题
转基因动物导致产生了伦理性问题，使用了曾经只属于自然的伟大力量——人为制造新的动物。特别是将人类的某些基因转移到动物上，已经引起了伦理道德的争议
提高外源基因在动物中的表达效率的策略
导入大片段
在大部分转基因研究中由于载体承载能力的限制，所构建的基因构建都比较小，从而使整合后的位置效应更明显。细菌人工染色体载体（BAC）和酵母人工染色体载体（YAC）的出现为大片段基因（200~500kb）转移，克服位置效应提供了可能。这是因为BAC和YAC载体的大容量能保证目的基因的完整性，保证所有顺式作用因子的完整性。因此，目的基因上下游侧翼序列可以消除或减弱基因整合后的“位置效应”而引起缓冲区域的作用，从而提高外源基因的表达水平。
增添基质附着区
添加基质附着区（MAR）可以使外源基因克服位置效应，MAR的介导见转基因植物。强调的是，MAR可以帮助转基因在不同的整合位点上形成完整的结构域，实现外源基因的表达。而MAR不惧有增强子的作用，因而不能提高外源基因的表达水平。
共整合和基因搭救
共整合和基因搭救即将表达水平较高的基因与另外一些表达水平低的基因一同整合进宿主细胞的基因组中（同一位点串联整合），这样的处理对增强表达水平低的基因构建的表达具有明显的作用。Clark（1992）等将oBLG基因与oBLG-hαIAT cDNA（1:1）及oBLG基因与oBLG-hFIX cDNA（3:1）注入小鼠原核期胚胎，结果表明hαIAT cDNA及hFIX cDNA的表达水平都得到了较大的提高。Yull等（1997）的研究结果表明这种搭救作用是由oBLG基因的转录作用引起。
基因打靶技术
建立在胚胎干细胞（embryonic stemcell，ES细胞）与同源重组技术基础之上的基因打靶技术(Gene targeting)是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。基因打靶技术是利用外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点上，从而改变细胞遗传特性的方法。使用该方法可以将外源基因定点整合到宿主细胞染色体的理想位点，避免由于位置效应导致的基因沉默。
加入基因座控制区
基因座控制区（locus controlregion，LCR）是染色体DNA上一种顺式作用元件，结构域中含有多种反式作用因子的结合序列，可能参与蛋白质因子的协同作用，使启动子处于无组蛋白状态。它具有使整合到宿主染色体中的外源基因不依赖其在基因组的位置而正确表达的功能。因此，在构建转基因表达结构时，若将基因座位控制区包括在内，将会使目的基因在转基因动物中实现不依赖整合位点、组织特异性的高效的表达。相反，没有基因座位控制区，被转移的基因将会受到邻近的基因调控元件的影响，产生位置效应，而影响表达。
利用具有组织与发育特异性调控作用的启动子和增强子
为实现外源基因在转基因动物中的高表达，如何选配设计启动子是一个关键的环节，对于非特异性表达的基因而言，可选用组成型和光谱型启动子，而对特异性表达的基因，所选用的启动子必须具有严格的时空作用特异性，例如发育时期特异性启动子、组织细胞特异性启动子和诱导表达特异性启动子等；有时为了增强基因的特异表达，还必须设计出单一型增强子和复合型增强子与其匹配。有些组织特异性表达的启动子不仅要求启动子元件与外源基因正确重组，而且与之相配的增强子元件与启动子之间的距离也需优化，同时还需使特异性表达所需的反式调节因子高表达并使其顺式作用元件发生作用。
添加内含子
一般结构基因有3种形式，分别是基因组基因（包括外显子和内含子）、cDNA和微型基因（即去除大部分内含子的基因组基因）。大量基因表达实验表明，基因组基因作为外源基因优于cDNA和微型基因。例如在利用β-球蛋白基因制备的转基因鼠中发现，采用含有内含子的基因组构件比采用cDNA提高表达10~100倍。目前关于内含子提高表达效率的机制，可能是由于以下几方面的原因：①内含子的剪接可增加mRNA在核内的稳定性，导致在细胞中积累更多成熟的mRNA；②某些内含子含有增强子或其他顺式作用元件的功能，它们同某些蛋白质结合影响转录的起始和延伸；③有的内含子可能含有能开放染色体的功能域，可通过影响核质成分、位置等来提高转基因动物的表达。
转基因动物的应用
改良和培育动物新品种
经典的遗传育种方法要在同种或亲源关系很近的种间才能进行，并且受到变异或突变的限制，而使用重组DNA技术在短时间内就可使亲缘关系很远的种间遗传信息进行交换和重组。另外由于转基因动物可以稳定地整合外源基因，并在合适的组织表达，还能将这种性状遗传给后代，这样就可以生产出生长快、产肉、产毛、产奶更多而耗料极少的转基因家畜，为家畜改良提供一条重要的途径。
研制和生产生物活性物质
将在医学领域中有价值的生物活性蛋白基因导入家畜或家禽的受精卵，在发育成的转基因动物体液或血液、乳、尿、腹水中收获基因产物，便可获得大量有价值的生物活性蛋白，通常将此动物称为“动物生物反应器”。其中以乳汁为最理想的分泌部位。目前，tPA(组织型纤溶蛋白元激活因子)已在转基因小鼠的乳汁中得到了表达，成为治疗血栓的理想药物。β-乳球蛋白在转基因小鼠中可表现出羊奶的主要成分——β-乳糖球蛋白。此外，凝血因子Ⅳ和α1-抗胰蛋白酶也在转基因绵羊中得到了表达。其他如乙型肝炎病毒抗原、卵泡刺激素、促黄体生成素等也都能按需要利用转基因动物生产，为医药、食品及畜牧业的发展开辟了极为广阔的天地。
