1. 原核受体细胞
原核受体细胞通常包括大肠杆菌、枯草杆菌和蓝细菌等。
原核受体细胞具有的优点为:①大部分原核细胞没有纤维素组成的坚硬的细胞壁,便于外源DNA的导入;②没有核膜,染色体DNA没有固定结合的蛋白质,这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦;③基因组简单,不含线粒体和质体基因组,便于对引入的外源DNA进行遗传分析;④原核细胞多数为单细胞生物,容易获得一致性的实验材料,并且培养简单,繁殖迅速,实验周期短,重复试验快
原核受体细胞具有的缺点为:①不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统,即使真核生物基因能得到表达,得到的多是无特异空间结构的多肽链;②缺乏真核生物的蛋白质加工系统,而许多真核生物的蛋白质的生物活性是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用;③原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白质,造成表达产物不稳定。
1.1 大肠杆菌
大肠杆菌(Escherichia coli)是革兰氏阴性菌,单个细胞大小为0.5×1~3微米,周身鞭毛,能运动,无芽孢。大肠杆菌是迄今为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类,也是基因工程研究和应用中发展最完善和成熟的受体系统。目前已有许多大肠杆菌菌株的染色体测序完毕,如:K-12美MG1655的全基因组长4000kb, 共含有4405个开放阅读框架,其大部分基因的生物功能已被鉴定。
大肠杆菌作为受体细胞的优点为:遗传背景清楚,载体受体系统完备,生长迅速,培养简便,代谢易于控制,适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建,是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。目前,人胰岛素、生长素和干扰素等均利用大肠杆菌工程菌株生产。其缺点:细胞膜间隙中含有大量的内毒素、荚膜等毒力因子,可导致人体的热源反应。
1.2 枯草芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是革兰氏阳性菌。单个细胞0.7~0.8×2~3微米,着色均匀,无荚膜,周生鞭毛,能运动,芽孢0.6~0.9×1.0~1.5微米,椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体不膨大。
枯草芽孢杆菌除具有大肠杆菌的优势外,其自身的优势为:(1)枯草杆菌具有胞外酶分泌—调节基因,能将基因表达产物高效分泌到培养基中,大大简化蛋白表达产物的提取和加工处理,而且在大多数情况下,真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然构象和生物活性;(2)不产生内毒素,无致病性,是一种安全的工程菌;(3)枯草杆菌具有芽孢形成能力,易于保存和培养。目前已成功利用枯草芽孢杆菌表达阿勒白细胞介导素、β干扰素和动物口蹄疫病毒VPI等抗原等。
1.3 蓝细菌
蓝细菌(Cyanobacteria)也称蓝藻或蓝绿藻,是一类分布很广、含有叶绿素a,无鞭毛,能够在光合作用时释放氧气的原核微生物。与光合细菌相比:光合细菌不产O2,有菌绿素。与绿色植物相比:无叶绿素b,有β-胡萝卜素和藻胆蛋白。蓝细菌主要以二分裂或多分裂方式进行繁殖,少数蓝细菌可形成孢子,孢子壁厚,能抵抗不良环境。由成串细胞连成丝状的蓝细菌,在细胞链断裂时形成的片段,称之为链丝段,具有繁殖功能。蓝细菌广泛分布于河流、湖泊、海洋等各种水体及各类植物(红萍等)叶腔中,具有固氮能力和对不良环境的抵抗能力,因此可在沙质海滩及荒漠上找到,并有“先锋生物”的美称。
蓝细菌的特点为:蓝藻是一类光能自养型生物,由于具有叶绿素a等光合色素(缺少叶绿素b)而能进行光合作用,同时释放氧气,因此蓝藻培养简便易行,营养条件要求低,可用于大规模生产;基因组简单,遗传背景比较清楚;由于密码子的偏向性和启动子的通用性,可能成为植物基因表达的宿主。以蓝细菌为生物反应器,大量生产药物、生物燃料等。
应用:高效表达PHB的蓝藻可用于降解塑料,另外,还用于药物、生物燃料的大量生产。
2. 真菌受体细胞
真菌是低等真核生物,其基因的结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都有真核生物的特征,因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。真菌受体细胞主要包括酵母菌和丝状真菌。
2.1 酵母菌
酵母菌(yeast)是单细胞微生物,它属于高等微生物的真菌类。它和高等植物的细胞一样,有细胞核、细胞膜、细胞壁、线粒体和相同的酵素和代谢途经。酵母菌无害,容易生长,空气中、土壤中、水中都存在酵母菌。酵母菌是结构最为简单的真核生物之一,作为一个真核生物表达系统,酵母菌的优势为:(1)酵母菌基因表达的调控机制比较清楚,遗传操作相对简单;(2)具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统;(3)不含特异性病毒,不产生内毒素,有些酵母属(如酿酒酵母)在食品工业中有着几百年的应用历史,属于安全型基因工程受体系统;(4)培养简单,利用大规模生产,成本低廉;(5)能将外源基因的表达产物分泌到培养基中,便于产物的提取和加工;(6)利用酵母表达动植物基因能在相当大的程度上阐明高等真核生物乃至人类基因表达调控的基本原理以及基因编码产物与功能之间的关系。因此,酵母是外源真核基因最理想的表达系统,在基因工程的研究和应用中具有极为重要的经济意义和学术价值。
2.2 丝状真菌
丝状真菌俗称霉菌(mold),意即"发霉的真菌",它广泛分布于土壤、水域、空气及动植物体内外,它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体,但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。霉菌在分类上属于真菌门的各个亚门,构成霉菌体的基本单位称为菌丝,呈长管状,宽度2~10μm,可不断自前端生长并分枝。无隔或有隔,具1至多个细胞核。大量菌丝交织成绒毛状、絮状或网状,称为菌丝体。菌丝体常呈白色、褐色、灰色,或呈鲜艳的额颜色,有的可产生色素使基质着色。霉菌的基因结构、表达调控机理,以及蛋白质加工与分泌都具有真核生物的特征,利用其表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的而有点。霉菌作为基因工程的受体细胞具有的特点为:(1)霉菌培养简单,可以大规模培养;(2)霉菌可以分泌表达目的基因产物,大大简化目标产物的分离纯化过程。以霉菌作为受体细胞可以高效表达抗生素、纤维素酶等产品,在医药、纺织、能源等领域有广泛的用途。
3. 真核受体细胞
高等真核受体细胞的种类包括植物受体细胞、动物受体细胞核人体胚胎干细胞等。
3.1 植物细胞
植物基因转化受体系统的条件
植物基因转化受体系统应具备的条件为:①高效稳定的再生能力。植物细胞具有全能性,但对于不同组织部位的细胞来说,其全能型存在明显差异,它与细胞的分化程度和生理状态有关。用于植物基因表达受体细胞的再生率一般要求高于80%,才能取得较好的效果;②较高的遗传稳定性,接受外源基因后其细胞分裂和分化应不受影响,并能稳定地将外源基因遗传给后代;③具有稳定的外植体来源;④对选择抗生素敏感,便于转化细胞后的筛选;⑤具有遗传改良价值。
植物基因转化外植体的选择原则
在受体系统满足上述条件的基础上,遵循以下原则选择外植体:①选择幼嫩的组织或器官,如近根部区、茎尖区、生长点区的组织、器官,或刚发芽的无菌实生苗叶片、子叶、胚轴等;②选择繁殖能力强的外植体,如胚是受精后发育而成的合子,具有很强的分省能力;③选择萌动期的外植体,代谢活跃、休眠萌动的细胞具有更强的生长潜能,更容易培养成功;④选择遗传纯合、稳定性好的外植体,不宜采用F1等遗传杂合体外外植体。常用的外植体为胚、幼穂、顶端分生组织、幼叶和幼茎等。
植物基因转化受体系统的种类和条件
植物基因转化的受体细胞包括植物愈伤组织受体体统、直接分化再生系统、原生质体受体系统、胚状体再生系统、生殖细胞再生系统和叶绿体受体系统。
1)愈伤组织再生系统
愈伤组织再生系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织,并通过分化培养获得再生植株的受体系统。其特点为:(1)愈伤组织易于接受外源基因,因此其转化率高(2)扩繁量大,可获得大量的转化植株;(3)外植体试材广泛;(4)该再生系统获得的再生植株无性系变异较大,转化的外源基因遗传稳定性较差;(5)再生植株嵌合体较多。
2)直接分化再生系统
直接分化再生系统是指外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。其特点为:(1)获得再生植株的周期短,操作简单;(2)体细胞无性系变异小,能较好的保持受体细胞的遗传稳定性;(3)转化效率低于愈伤组织再生系统;(4)再生植株嵌合体也较多。
3)原生质体再生系统
原生质体是植物细胞除去细胞壁后的部分,具有全能性,在合适的条件下能再生完整植株。其特点为:(1)原生质体被除去了细胞壁这一天然屏障,能够直接高效地摄取外源DNA或遗传物质,甚至细胞核;(2)通过原生质体培养,细胞分裂可形成基因型一致的细胞克隆,嵌合体少;(3)原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定;(4)原生质体培养用期长、难度大,再生频率低;(5)遗传变异大,遗传传稳定性差。
4)胚状体再生系统
植物体细胞胚胎发生是指二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的情况下,模拟有性合子胚胎发生的各个阶段而发育形成一个新的个体的形态发生过程。经体细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构,称之为体细胞胚或胚状体。其特点为:(1)胚状体是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来,这些胚性细胞具有很强的接收外源DNA的能力转化率和转化效率均高;(2)多数单细胞起源,嵌合体少;(3)胚状体具有两极性,即在发育过程中同时可分化出芽和根形成完整植株,这样减少了不定芽发育途径中比较困难的一个环节——生根培养;(4)利用转基因的胚状体可以生产人工种子;(5)体细胞胚成苗快、数量大有利于生产和推广。
5)生殖细胞受体系统
生殖细胞受体系统是指在开花植物有性生殖过程中,利用植物生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统,也称之为种质系统。目前利用生殖细胞进行转化的途径有两条:一是生殖细胞的离体培养,即利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养,诱导出胚性细胞或愈伤组织,进一步分化发育成单倍体植株,从而建立单倍体的基因转化系统;二是活体上直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化,如花粉管导入法和花粉粒浸泡法等。其特点为:(1)有更强的接收外源DNA的能力;(2)能使转基因充分表达,而且通过加倍后即可成为纯合二倍体,加速纯化过程;(3)利用植物自身的授粉过程操作方便;(4)利用该受体系统进行转化受到季节的限制,只能在开花期进行,且无性繁殖的植物不宜采用。
6)叶绿体受体系统
大叶绿体是植物细胞和真核藻类的肢体细胞器之一,是光合作用的场所。单个植物细胞中叶绿体基因组有1 000~10 000个基因拷贝,并且大多数被子植物中是母系遗传。大部分叶绿体NDA都是共价闭合双链环状分子,少数为线状。叶绿体基因组具有原核性,其突出特点是具有相同或相关功能的基因组成复合操纵子结构,这一特点有利于叶绿体基因的表达与调控。因此,叶绿体作为外源基因转化的受体系统具有的优越性表现在:(1)便于外源基因定位整合,消除“位置效应”;(2)基因为多拷贝,表达量高;(3)导入的外源基因性状稳定性高、安全性好;(4)能直接表达原核生物;(5)目的基因产物对植物的影响较小。
3.2动物细胞
动物是多细胞真核生物,有组织和器官的分化,它与人类的关系密切,为人类提供主要的氮素营养来源。动物转基因受体细胞包括体细胞和生殖细胞,目前多数采用性细胞、受精卵或胚胎细胞作为受体细胞,并由此培育出转基因动物。
近年来随着体细胞克隆技术的发展和完善,越来越多的动物体细胞被用作转基因受体细胞。常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、HeLa细胞、猴肾细胞核中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。目前作为基因转移的受体动物包括昆虫、鱼类、牛羊等哺乳动物,猴和猩猩等灵长动物。
哺乳动物细胞作为受体细胞的优点为:(1)能识别和除去外源真核基因中的内含子,剪接加工成成熟的mRNA;(2)真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确的加工和修饰,产物具有较好的蛋白质免疫性,为酵母菌的16~20倍;(3)易被重组质粒 转染,具有遗传稳定性和可重复性;(4)经转化的动物细胞可将其表达产物分泌到培养基上,便于提纯和加工,成本低。缺点为:组培技术要求高,难度大,如培养和筛选一个高度扩增的转化子CHO细胞。通常需要数月之久,难度较大。