PCR分离目的基因

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是利用酶促反应在体外指导特定DNA序列扩增的方法，是以热变性的双链DNA为模板，利用引物和4种脱氧核苷酸为原料在DNA聚合酶的作用下大量扩增特定的DNA片段。PCR被看作生物体外的特殊DNA复制。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍（图1）。

PCR反应特点

特异性强

PCR反应的特异性主要取决于引物与模板DNA按碱基配对原则特异性结合以及TaqDNA聚合酶催化反应的忠实性。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的，加之聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物结合可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大提高，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的真实性，再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

灵敏度高

PCR产物的理论生成量是以指数方式增加的，能将皮克量级的起始待测模板扩增到微克量级。能从100万个细胞中检出一个靶细胞。

简便、快速

PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性加入反应液（DNA扩增液）在基因扩增仪上进行变性—退火—延伸反应，一般在1～4 h完成扩增反应，扩增产物一般用电泳分析，通常不涉及同位素，无放射性污染、易推广。

对模板的纯度要求低

对于病毒或单细胞，有时不需要分离病毒或细菌及培养细胞的DNA ，直接加热裂解后释放的DNA、RNA均可作为扩增模板。

利用PCR克隆已知序列的目的基因

利用PCR克隆已知+未知序列的目的基因（部分已知）

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