Mol Plant｜电子科技大学张勇及马里兰大学YiPing Qi组报道了基于Prime Editing的植物基因组编辑新系统
2020年3月26日，Molecular Plant 在线发表了电子科技大学张勇课题组及马里兰大学Yiping Qi题为“Plant prime editors enable precise gene editing in rice cells”的研究工作，报道了”Prime Editing（PE）”策略介导的植物基因组编辑新系统，基于水稻基因组多基因多位点通量数据分析基础上，对其编辑活性、编辑特性等关键问题进行了解读，为PE基因组编辑系统在植物中的有效应用提供了基础工具及实施方案，进一步拓展了植物基因组编辑工具箱。
自2012年以来，基于CRISPR-Cas的基因组编辑系统以前所未有的广度、深度影响了生命科学及相关学科的基础研究及应用实践，但目前主要的基因组编辑类型依然是在CRISPR-Cas定向剪切基因组DNA后，基于非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）修复途径实现的序列缺失、插入突变。由于大部分多细胞真核生物，特别是高等植物细胞另一DNA断裂修复途径，同源重组（homologous recombination，HR），效率较低，基于CRISPR-Cas编辑系统的精准序列替换编辑事件实现较为困难，极大限制了基因组编辑技术有效应用。近年来，通过融合不同类型脱氨酶结构域，研究者开发了”C to T”、”A to G”的CRISPR-Cas单碱基编辑工具，一定程度上弥补了现有基因组编辑工具的短板，但并没有有效解决对全基因组无差别精准编辑的实际需要，因此开发更加高效且广谱的精准基因组编辑工具一直是研究者努力的重要方向。
2019年末，研究者以CRISPR-Cas9系统为基础，将M-MLV RT逆转录酶与Cas9蛋白（Cas9-H840A：切割PAM位点所在DNA链）融合，并在sgRNA序列3’端增加一段RNA序列（修订后的sgRNA命名为pegRNA），使得Cas9（H840A）：：M-MLV RT逆转录酶融合蛋白可以在pegRNA的PBS元件（引物结合位点）引导下，在PAM位点所在DNA链切口3’末端引发逆转录，并依据pegRNA中RT序列（RT：逆转录模板，携带有目标点预设编辑序列）进行DNA新链合成，进而基于DNA切口修复途径将预设的编辑碱基引入基因组，在人源及小鼠细胞中实现了无需DNA模板的全部类型单碱基替换及多碱基精准插入、删除（Anzalone et., 2019）。
基于PE策略可以实现非DNA模板依赖全类型单碱基替换及多碱基精准编辑，无疑为基因编辑领域带来了重大变革。由于动、植物在基因组结构、表达特性及生存环境等的明显差异，该系统是否可以在植物基因组编辑中有效使用，进一步的编辑效率、编辑模式、位点偏好等植物基因组编辑重要信息均需明确阐释。电子科技大学张勇教授、马里兰大学YiPing Qi博士课题组，基于此前高效CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12及CRISPR-Cas12b植物基因组编辑系统开发基础上， 构建了3种不同类型的植物PE基因组编辑新系统(PPE3/b-V01、PPE2-V02、PPE3-V02)，在水稻基因组中明确检测到pegRNA导向的目标位点全类型碱基替换、删除及插入编辑，基于原生质体瞬时编辑系统及高通量测序分析策略，对基于PE策略的植物基因组编辑活性、编辑特性等关键问题进行了解读。
该研究工作，首先针对人源细胞中编辑效率较高的PE3系统，构建了植物Prime Editor版本01（PPE3-V01），其中基于水稻密码子偏好的Cas9（H840A）：：M-MLV RT融合蛋白由ZmUbi1 Pol II启动子驱动转录，pegRNA及nsgRNA小分子RNA由OsU3、OsU6 Pol III启动子分别驱动转录（图1A）。针对水稻4个内源基因的5个不同编辑位点，在PBS、RT均为13nt时，基于PPE3-V01系统扼水稻原生质体瞬时表达及高通量测序（HTS）分析，检测到较低但明确的基于PE策略的编辑活性（0.05-0.15％）（图1B、1C），初步证实了PE编辑策略在植物细胞中的可实现性。进一步分析HTS测序结果，发现编辑细胞中存在较高比例的长片段缺失编辑事件，推测其可能是由于PE3系统中同时由pegRNA及nsgRNA配对产生了2个切口造成的副产物（图1C）。
为使此类缺失编辑副产物最小化，并提升PE系统中基于RT模板序列的精准编辑，作者采用PB3b策略，针对水稻5个内源基因，采用多元PBS及RT设计参数（13nt-23nt、不同编辑事件类型），再次明确检测到基于PE策略的精准编辑事件，基于PPE3b-V01系统的最高编辑效率较PPE3-V01提升了3倍（图1D），且进一步实现了编辑位点处多碱基、不连续类型的复杂编辑（图1E）。
在明确证明植物细胞中PE编辑策略的可实现性基础上，为了进一步提升编辑效率，作者从Cas9（H840A）：：M-MLV RT融合蛋白密码优化、表达调控及细胞定位、egRNA及nsgRNA小分子RNA转录控制等多个角度进行了基因工程优化，构建了Prime Editor版本02的两个植物PE系统（PPE2-V02、PPE3-V02）（图1F）。
针对水稻2个内源基因的25个不同编辑位点，进一步测试了不同PBS长度、RT长度、编辑事件类型、nsgRNA等因素对PE编辑效率的影响。结果表明，相较PPE3/b-V01，PPE2-V02及PPE3-V02编辑系统明确提升了水稻内源基因PE编辑效率，最高PE编辑位点效率为1.55%，但不同位点PE编辑效率明显受PBS、RT设计参数影响（见上图1G-1I、1M、1O）。值得注意的是，相较PPE3/b-V01系统，PPE2-V02及PPE3-V02系统在提升PE编辑事件效率的同时，都明显降低了非PE策略的删除编辑副产物（图1J-1L、1N）。进一步，考虑到M-MLV RT可能需要较高温度体现最佳活性，作者测试了37°C下PPE3-V02系统编辑活性，但与研究中32°C水稻细胞培养条件相较，并未发现编辑效率有明显提升（附图2）。
基于以上研究工作，作者构建了3种不同的植物PE编辑系统（PPE3/b-V01、PPE2-V02、PPE3-V03），进而基于水稻原生质体瞬时表达及HTS通量数据分析，针对水稻基因组多基因多位点，明确证明了PE编辑策略在植物细胞中的可实现性，并对PE编辑系统的植物基因组编辑活性、编辑特性等关键问题进行了解读，拓展了植物基因组编辑工具箱。特别需要指出的是，基于该研究工作，一方面提供了与人源细胞类似的结果（如：目标位点编辑效率明显依赖PBS、RT、编辑类型、nsgRNA等变量因素），另一方面也明确说明植物系统中PE编辑策略实现存在一定程度特殊性（如：PE2、PE3、PE3b编辑策略对应的编辑活性与人源及小鼠细胞中的结论并不一致），为进一步系统工程优化植物PE基因组编辑系统，提供了明确信息及材料基础。
