基因工程原理与技术

范桂枝，詹亚光 ，曾凡锁， 齐凤慧，尹静

目录

  • 1 基因工程绪论
    • 1.1 知识要点
    • 1.2 基因工程定义
    • 1.3 基因工程的诞生
    • 1.4 基因工程的技术路线
    • 1.5 基因工程的研究内容
    • 1.6 基因工程的安全性
    • 1.7 基因工程的应用
    • 1.8 学习和研究基因工程的意义
    • 1.9 思考题
    • 1.10 本章节参考资料
    • 1.11 调查问卷
  • 2 工具酶
    • 2.1 知识要点
    • 2.2 工具酶定义
    • 2.3 限制性内切酶
      • 2.3.1 限制性内切酶的定义
      • 2.3.2 限制性内切酶的种类
      • 2.3.3 限制性内切酶的命名
      • 2.3.4 限制性内切酶的切割频率
      • 2.3.5 限制性内切酶切割效率
        • 2.3.5.1 星号活性
      • 2.3.6 限制性内切酶切割方式
    • 2.4 连接酶
      • 2.4.1 连接酶的种类和连接条件
      • 2.4.2 连接机理
      • 2.4.3 连接效率
    • 2.5 聚合酶
    • 2.6 其他工具酶
    • 2.7 章节测试
  • 3 载体
    • 3.1 知识要点
    • 3.2 载体的功能和种类
    • 3.3 质粒载体
      • 3.3.1 质粒的基本生物学特征
      • 3.3.2 质粒载体的构建
      • 3.3.3 质粒载体的种类
    • 3.4 噬菌体载体
      • 3.4.1 M13噬菌体载体
      • 3.4.2 λ噬菌体载体
      • 3.4.3 噬菌体—质粒杂合载体
    • 3.5 人工染色体载体
    • 3.6 拓展知识-纳米载体
    • 3.7 章节测试
  • 4 受体细胞recipient cells
    • 4.1 知识要点
    • 4.2 受体细胞的定义
    • 4.3 受体细胞的条件
    • 4.4 受体细胞的种类
    • 4.5 章节测试
  • 5 目的基因的获取target genes
    • 5.1 知识要点Key points
    • 5.2 目的基因的定义Definition of target gene
    • 5.3 目的基因的获取途径Access to target genes
    • 5.4 直接分离方法Direct separation method
    • 5.5 PCR方法获取目的基因
    • 5.6 化学合成DNA  chemosynthesis
    • 5.7 基因文库gene library
    • 5.8 改造目的基因Modification of target gene
    • 5.9 案例分析
    • 5.10 章节测试
  • 6 DNA重组的Recombinant DNA
    • 6.1 知识要点key points
    • 6.2 重组子的构Construction of recombinons
    • 6.3 重组DNA分子的转化和扩增
    • 6.4 重组子的筛选与鉴定
    • 6.5 知识拓展
    • 6.6 章节测试
  • 7 转基因生物
    • 7.1 大肠杆菌基因工程
      • 7.1.1 表达载体
      • 7.1.2 受体系统
      • 7.1.3 表达策略
      • 7.1.4 案例
      • 7.1.5 章节测试
    • 7.2 植物基因工程
      • 7.2.1 转基因植物现状
      • 7.2.2 载体
      • 7.2.3 受体系统
      • 7.2.4 转化方法
      • 7.2.5 基因沉默
      • 7.2.6 案例
      • 7.2.7 章节测试
      • 7.2.8 农杆菌英文课件和资料
    • 7.3 动物基因工程
      • 7.3.1 转化方法
      • 7.3.2 转基因动物的鉴定
      • 7.3.3 提高外源基因在动物中的表达效率的策略
    • 7.4 酵母基因工程
      • 7.4.1 新建课程目录
  • 8 课后阅读
    • 8.1 英文参考书
    • 8.2 转基因食品安全-天使还是魔鬼
    • 8.3 荧光素酶报告基因
    • 8.4 大豆　发芽和转基因有关系吗？
    • 8.5 苦参碱-基因工程改良
    • 8.6 Prime Editing的植物基因组编辑新系统
    • 8.7 液体黄金将借油菜合成
    • 8.8 青蒿素生物合成相关背景
    • 8.9 模式植物拟南芥
    • 8.10 如何利用生物技术培育功能性水稻
    • 8.11 一种高效的油菜转基因和极早期快速和快捷的筛选方法！
    • 8.12 新基因工具有望揭开海洋微生物之谜
    • 8.13 研发中的新冠病毒疫苗包括哪些类型
    • 8.14 基因是如何被调节的
    • 8.15 转化机理综述2019年
    • 8.16 新型报告基因
    • 8.17 2021年太空基因编辑
  • 9 基因工程实验
    • 9.1 实验课简介
    • 9.2 模块一、木本植物的遗传转化
      • 9.2.1 模块一内容的虚拟仿真部分
      • 9.2.2 实验目的及原理
      • 9.2.3 实验内容
        • 9.2.3.1 实验一  菌种活化
          • 9.2.3.1.1 操作方法与思考题
        • 9.2.3.2 实验二  三亲交配法将中间载体质粒导入根癌农杆菌
          • 9.2.3.2.1 三亲杂交原理
          • 9.2.3.2.2 操作方法与思考题
        • 9.2.3.3 实验三 抗生素的敏感性实验
          • 9.2.3.3.1 抑菌原理
          • 9.2.3.3.2 操作方法与思考题
        • 9.2.3.4 实验四  农杆菌介导法的植物遗传转化
          • 9.2.3.4.1 农杆菌介导的转化原理
          • 9.2.3.4.2 操作方法与思考题
        • 9.2.3.5 实验五 基因编辑及原生质体的瞬时转化
          • 9.2.3.5.1 基因编辑原理
          • 9.2.3.5.2 操作方法与思考题
    • 9.3 模块二、转基因植物的检测与鉴定
      • 9.3.1 模块二内容的虚拟仿真实验部分
      • 9.3.2 模块二实验综合内容
      • 9.3.3 实验目的及原理
      • 9.3.4 实验内容
        • 9.3.4.1 实验五 转基因白桦基因组DNA提取
          • 9.3.4.1.1 操作方法与思考题
        • 9.3.4.2 实验六  转基因白桦的多重PCR检测
          • 9.3.4.2.1 操作方法与思考题
        • 9.3.4.3 实验七  外源基因DNA甲基化转基因沉默的关系分析
          • 9.3.4.3.1 操作方法与思考题
        • 9.3.4.4 实验八  外源基因整合的Southern杂交鉴定
          • 9.3.4.4.1 杂交原理与操作
          • 9.3.4.4.2 操作方法与思考题
        • 9.3.4.5 实验九 转基因白桦的RT-PCR检测
          • 9.3.4.5.1 操作方法与思考题
        • 9.3.4.6 实验十 转基因植物中报告基因表达检测-- GUS活性检测
          • 9.3.4.6.1 操作方法与思考题
案例分析
植物细胞色素P450（以下简称P450）是一类以血红素为辅基的细胞色素超家族蛋白酶，催化生物体内多种复杂化学反应，也是导致植物天然化合物结构多样、功能各异的重要原因。相关研究一直是植物代谢研究领域的重点与难点。

2021年10月，云南师范大学马铃薯科学研究院尚轶团队联合中国农业科学院(深圳)农业基因组研究所科研人员在aBIOTECH上发表了题为“Enhanced chemoselectivity of a plant cytochrome P450 through proteinengineering of surface and catalytic residues”的研究论文，通过同时优化蛋白表面与活性中心氨基酸位点提高植物P450酶的活性和底物选择特异性。
葫芦素和罗汉果醇同为植物三萜类化合物，具有相同的骨架和类似的化学结构（图1）。罗汉果醇是罗汉果苷的前体，后者是天然的非糖甜味剂，被广泛应用于食品领域。由于两者化学结构十分相似，参与葫芦素C合成的P450酶经过改良有望构建一条新的罗汉果醇合成途径（图1）。


图1 葫芦素C合成途径及利用葫芦素C合成酶拟构建的新的罗汉果醇合成通路

2016年，尚轶课题组开发了一套基于蛋白设计软件Rosetta和氨基酸共进化信息改造植物酶基因功能的研究策略(Ma et al. 2016)。2019年，团队成功应用该策略将参与葫芦素C合成的多功能P450酶CYP87D20改造为单加氧酶，可定向催化葫芦二烯醇生成罗汉果醇前体11-羟基葫芦二烯醇(Li et al. 2019)。为进一步提高CYP87D20突变体蛋白在酵母中的表达活性，本研究选择蛋白表面氨基酸位点进行优化。经过3轮共计17个突变体的迭代测试，发现将蛋白表面优化与活性区域氨基酸位点突变相叠加，创制出目前活性最好的11-羟基葫芦二烯醇合成酶（图2）。


11H-Cuol,11-羟基葫芦二烯醇；11C-Cuol, 11-羰基葫芦二烯醇；11C-20H-Cuol, 11-羰基-20-羟基葫芦二烯醇

图2 CYP87D20突变体的催化产物检测 (A) 和蛋白表达水平检测（B）