基因工程原理与技术

范桂枝，詹亚光 ，曾凡锁， 齐凤慧，尹静

目录

  • 1 基因工程绪论
    • 1.1 知识要点
    • 1.2 基因工程定义
    • 1.3 基因工程的诞生
    • 1.4 基因工程的技术路线
    • 1.5 基因工程的研究内容
    • 1.6 基因工程的安全性
    • 1.7 基因工程的应用
    • 1.8 学习和研究基因工程的意义
    • 1.9 思考题
    • 1.10 本章节参考资料
    • 1.11 调查问卷
  • 2 工具酶
    • 2.1 知识要点
    • 2.2 工具酶定义
    • 2.3 限制性内切酶
      • 2.3.1 限制性内切酶的定义
      • 2.3.2 限制性内切酶的种类
      • 2.3.3 限制性内切酶的命名
      • 2.3.4 限制性内切酶的切割频率
      • 2.3.5 限制性内切酶切割效率
        • 2.3.5.1 星号活性
      • 2.3.6 限制性内切酶切割方式
    • 2.4 连接酶
      • 2.4.1 连接酶的种类和连接条件
      • 2.4.2 连接机理
      • 2.4.3 连接效率
    • 2.5 聚合酶
    • 2.6 其他工具酶
    • 2.7 章节测试
  • 3 载体
    • 3.1 知识要点
    • 3.2 载体的功能和种类
    • 3.3 质粒载体
      • 3.3.1 质粒的基本生物学特征
      • 3.3.2 质粒载体的构建
      • 3.3.3 质粒载体的种类
    • 3.4 噬菌体载体
      • 3.4.1 M13噬菌体载体
      • 3.4.2 λ噬菌体载体
      • 3.4.3 噬菌体—质粒杂合载体
    • 3.5 人工染色体载体
    • 3.6 拓展知识-纳米载体
    • 3.7 章节测试
  • 4 受体细胞recipient cells
    • 4.1 知识要点
    • 4.2 受体细胞的定义
    • 4.3 受体细胞的条件
    • 4.4 受体细胞的种类
    • 4.5 章节测试
  • 5 目的基因的获取target genes
    • 5.1 知识要点Key points
    • 5.2 目的基因的定义Definition of target gene
    • 5.3 目的基因的获取途径Access to target genes
    • 5.4 直接分离方法Direct separation method
    • 5.5 PCR方法获取目的基因
    • 5.6 化学合成DNA  chemosynthesis
    • 5.7 基因文库gene library
    • 5.8 改造目的基因Modification of target gene
    • 5.9 案例分析
    • 5.10 章节测试
  • 6 DNA重组的Recombinant DNA
    • 6.1 知识要点key points
    • 6.2 重组子的构Construction of recombinons
    • 6.3 重组DNA分子的转化和扩增
    • 6.4 重组子的筛选与鉴定
    • 6.5 知识拓展
    • 6.6 章节测试
  • 7 转基因生物
    • 7.1 大肠杆菌基因工程
      • 7.1.1 表达载体
      • 7.1.2 受体系统
      • 7.1.3 表达策略
      • 7.1.4 案例
      • 7.1.5 章节测试
    • 7.2 植物基因工程
      • 7.2.1 转基因植物现状
      • 7.2.2 载体
      • 7.2.3 受体系统
      • 7.2.4 转化方法
      • 7.2.5 基因沉默
      • 7.2.6 案例
      • 7.2.7 章节测试
      • 7.2.8 农杆菌英文课件和资料
    • 7.3 动物基因工程
      • 7.3.1 转化方法
      • 7.3.2 转基因动物的鉴定
      • 7.3.3 提高外源基因在动物中的表达效率的策略
    • 7.4 酵母基因工程
      • 7.4.1 新建课程目录
  • 8 课后阅读
    • 8.1 英文参考书
    • 8.2 转基因食品安全-天使还是魔鬼
    • 8.3 荧光素酶报告基因
    • 8.4 大豆　发芽和转基因有关系吗？
    • 8.5 苦参碱-基因工程改良
    • 8.6 Prime Editing的植物基因组编辑新系统
    • 8.7 液体黄金将借油菜合成
    • 8.8 青蒿素生物合成相关背景
    • 8.9 模式植物拟南芥
    • 8.10 如何利用生物技术培育功能性水稻
    • 8.11 一种高效的油菜转基因和极早期快速和快捷的筛选方法！
    • 8.12 新基因工具有望揭开海洋微生物之谜
    • 8.13 研发中的新冠病毒疫苗包括哪些类型
    • 8.14 基因是如何被调节的
    • 8.15 转化机理综述2019年
    • 8.16 新型报告基因
    • 8.17 2021年太空基因编辑
  • 9 基因工程实验
    • 9.1 实验课简介
    • 9.2 模块一、木本植物的遗传转化
      • 9.2.1 模块一内容的虚拟仿真部分
      • 9.2.2 实验目的及原理
      • 9.2.3 实验内容
        • 9.2.3.1 实验一  菌种活化
          • 9.2.3.1.1 操作方法与思考题
        • 9.2.3.2 实验二  三亲交配法将中间载体质粒导入根癌农杆菌
          • 9.2.3.2.1 三亲杂交原理
          • 9.2.3.2.2 操作方法与思考题
        • 9.2.3.3 实验三 抗生素的敏感性实验
          • 9.2.3.3.1 抑菌原理
          • 9.2.3.3.2 操作方法与思考题
        • 9.2.3.4 实验四  农杆菌介导法的植物遗传转化
          • 9.2.3.4.1 农杆菌介导的转化原理
          • 9.2.3.4.2 操作方法与思考题
        • 9.2.3.5 实验五 基因编辑及原生质体的瞬时转化
          • 9.2.3.5.1 基因编辑原理
          • 9.2.3.5.2 操作方法与思考题
    • 9.3 模块二、转基因植物的检测与鉴定
      • 9.3.1 模块二内容的虚拟仿真实验部分
      • 9.3.2 模块二实验综合内容
      • 9.3.3 实验目的及原理
      • 9.3.4 实验内容
        • 9.3.4.1 实验五 转基因白桦基因组DNA提取
          • 9.3.4.1.1 操作方法与思考题
        • 9.3.4.2 实验六  转基因白桦的多重PCR检测
          • 9.3.4.2.1 操作方法与思考题
        • 9.3.4.3 实验七  外源基因DNA甲基化转基因沉默的关系分析
          • 9.3.4.3.1 操作方法与思考题
        • 9.3.4.4 实验八  外源基因整合的Southern杂交鉴定
          • 9.3.4.4.1 杂交原理与操作
          • 9.3.4.4.2 操作方法与思考题
        • 9.3.4.5 实验九 转基因白桦的RT-PCR检测
          • 9.3.4.5.1 操作方法与思考题
        • 9.3.4.6 实验十 转基因植物中报告基因表达检测-- GUS活性检测
          • 9.3.4.6.1 操作方法与思考题
新型报告基因
报告基因（reporter gene）是生物学研究的重要元件，广泛应用到遗传转化、组织表达、转录调控以及蛋白互作等研究领域。目前，已有多种报告基因系统，如荧光蛋白（GFP、RFP和CFP等）、β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）以及荧光素酶（LUC）被开发出来。需要指出的是，这些系统一方面必须借助特殊仪器设备（荧光激发器）或昂贵的底物（X-Gluc和萤光素等）才得以观察，另一方面难以较好应用到对大型植物的研究中。


近日，南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室作物基因编辑创新团队与美国加州大学圣地亚哥分校（UCSD）赵云德教授在Horticulture Research杂志发表了题为“A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation”的封面文章。报道了一种新的、裸眼可见的植物通用性便捷报告系统RUBY。

近年来，我们团队探索发现某些植物色素可以作为报告分子。甜菜红素是一类可以由酪氨酸为底物经三种酶（CYP76AD1、DODA、GT）催化合成的植物天然产物。甜菜、火龙果和其他植物中见到的鲜红色就是甜菜红素积累的结果。众所周知，酪氨酸是各类生物最常用的氨基酸之一，因此若能使用酪氨酸作为底物来合成甜菜红素，并以甜菜红素作为报告分子，就可以避免外源底物的添加。因此，我们设计了一种全新的报告系统，将CYP76AD1，DODA和GT偶联到一个开放的阅读框中，将其名为RUBY（红宝石）。我们推测利用RUBY报告系统，可以从产生的红色推断出特定基因的表达情况。

随后我们根据设计方案，成功在双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植物水稻中分别验证了我们新创制的RUBY报告系统能有效发挥预期的功能（图1）。在拟南芥中，我们分别通过组成型启动子35S和UBQ、组织特异表达基因At2S3和YUC4的启动子驱动RUBY表达，得到了与前期研究相一致的结果（图1a-d）。 在水稻中，我们利用RUBY产生的颜色即可区分转基因（红色）和非转基因愈伤组织（淡黄色）（图1e）。此外，我们发现RUBY报告系统也可以用于荧光蛋白报告系统无法较好观察的叶片等绿色组织（图1g，1h）。

图1. RUBY报告基因用于检测基因表达和指示植物遗传转化。
本研究开发的RUBY报告系统不依赖专用设备或昂贵的耗材，有望应用于无法较好使用抗生素或除草剂筛选的转化体系以及大型植物的研究。此外，RUBY报告系统可以进行原位观察，不用进行取样或试剂处理，有效规避了无菌材料被污染的风险，并且能避免因为取样时的机械外力刺激使相关基因的表达模式受到干扰。因此RUBY报告系统是一种天然无害、观察方便、节省成本的报告系统，是现有植物遗传转化及基因表达报告系统的优良替代方案。

本研究得到了国家转基因生物新品种培育重大专项、南京农业大学科研启动经费以及塔塔遗传与社会研究所博士后基金的支持。南京农业大学和玉兵博士与UCSD张涛博士为共同第一作者，赵云德教授与和玉兵博士为论文共同通讯作者。

南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室作物基因编辑创新团队致力于开发高效便捷且适用面广的植物遗传转化与基因编辑系统。团队现招聘博士后2名，欢迎有志在植物基因编辑领域一起开拓创新的伙伴加入我们，让我们一起激扬梦想、碰撞思维。新加入的博士后可以直接受聘为钟山青年研究员，年薪23 万元起。钟山青年研究员在聘期内因研究需要，经学院及相关职能部门批准，可申请短期出国进行学术交流或合作研究。聘任期结束后，学校对期进行聘期考核，考核表现为优者可以选择与学校签订聘用合同，正式入编，聘为副教授（特别优秀者可以直接聘为教授）。
联系方式：yubinghe@njau.edu.cn

文章链接：
https://www.nature.com/articles/s41438-020-00390-1