2.3限制性内切核酸酶
2.3. 1限制性内切酶（Endonucleosase）的发现与分类
限制性内切酶（Restrictionendonuclease）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4~8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h内中完全降解1 mg l DNA所需要的酶量。
1）限制性核酸内切酶的发现
Cohen和 Boyer成功的DNA重组实验主要依赖于一种特殊的酶—限制性内切酶。限制性内切酶于20世纪60年代在研究细菌限制性和修饰现象时被Linn 和Arber在大肠杆菌中发现。这些酶因能阻止外源DNA的入侵而得名，如能切割降解噬菌体DNA而限制外源DNA。限制性内切酶的切点在外源DNA的内部而不是从末端切起，所以叫内切酶。但是如果它们可以切掉入侵的病毒DNA，为什么它不会破坏宿主细胞自身的DNA？答案是：几乎所有的限制性内切酶都要和能识别而且甲基化相同DNA位点的甲基化酶共同作用。这两个酶—限制性内切酶和甲基化酶一起称为限制-修饰系统，或者R-M系统。寄主的R-M有两方面的作用，一是保护自身的DNA不受限制；二是破坏外源DNA使之迅速降解。
Linn 和Arber希望他们发现的这种酶能在特异的位点切割DNA片段，成为一把切割DNA的“分子剪刀”，但不幸的是当时发现的这种酶没有特异性的切割位点。然而，Hamilton和Smith在嗜血流感菌中发现的Hind II具有特异的位点切割性，这为基因工程技术的诞生奠定了基础。截止到目前为止，已经分离出400余种限制性内切酶，其中商品化的约有100余种，而实验室常用的有20余种。
2）限制性核酸内切酶的分类
目前已经鉴定出三种不同类型的核酸内切酶，即I型酶、II型酶、III型酶。这三种不同类型的限制酶具有不同的特性（表2-2）。其中II型酶，由于其核酸内切酶活性和甲基化作用是分开的，而且核酸内切作用又具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
表2-2 核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性 | I型 | II型 | III型 |
限制和修饰活性 | 单一多功能的酶 | 内切酶和甲基化酶分开 | 共同亚基的双功能酶
|
核酸内切酶的蛋白结构 | 3种不同的亚基 | 单一成分 | 2种不同的亚基 |
限制作用所需要的辅助因子 | ATP、 Mg2+和SAM
| Mg2+
| ATP、 Mg2+和SAM
|
寄主特异性位点识别序列 | EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC | 回文序列 （IIs型除外） | EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG |
切割位点 | 在距离识别位点至少1000 bp处随机切开一条单链。 | 位于寄主特异性位点或其附近 | 距寄主特异性位点3′端24—26bp处 |
酶催转换 | 不能 | 能 | 能 |
DNA易位作用 | 能 | 不能 | 不能 |
甲基化作用的位点 | 寄主特异性位点 | 寄主特异性位点 | 寄主特异性位点 |
识别未甲基化的序列进行切割 | 能 | 能 | 能 |
序列特异的切割 | 不是 | 是 | 是 |
基因工程中的用途 | 无用 | 十分有用 | 用处不大 |
2.3.2限制性核酸内切酶的命名
由于发现的限制性内切酶越来越多，所以需要一个统一的命名体系。Smith和Nathans(1973)提出了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系的一个简化版。其主要特征是：
（1）用属名的第一个字母和种名的前两个字母，组成3个斜体字母的略语表示寄主菌的物种名称，例如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。
（2）用一个正体字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用d，即Hind。
（3）如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为Hind I、Hind II、Hind III等。
（4）所有的限制酶，除了总的名称限制性内切核酸酶R外，还带有系统的名称，如核酸内切酶R. Hind III。同样的，修饰酶则在它的系统名称之前加上甲基化酶M的名称。相应于核酸内切酶R. Hind III的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名甲基化酶M.Hind III。在上下文十分清楚且涉及限制酶的情况下，R. 可省去。
2.3.3 II型限制性核酸内切酶的基本特性
1）限制酶识别序列的长度
限制酶识别序列的长度一般为4~8个碱基，最常见的为6个碱基。当识别序列为4个和6个碱基时，它们识别的序列在完全随机的情况下，平均每256和4 096个碱基中会出现一个识别位点（44=156，46=4 096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置：
4个碱基识别位点：Sau3AI ↓GATC
5个碱基识别位点：EcoR II ↓CCWGG (W=A或T)
6个碱基识别位点：EcoR I G↓AATTC
7个碱基识别位点：BbvCI CC↓TCAGC
8个碱基识别位点：NotI GC↓GGCCGC
2）识别序列的结构
限制性内切酶识别序列的结构一般为具有180°旋转对称的回文结构（palind romic sequence），即识别位点的DNA序列从5′到3′的阅读序列相同，如EcoR I的识别序列为5′-G AATTC-3′；3′-CTTAAG-5′。但是有一些酶的识别序列是不对称的，如AccBS I（CCGCTC）和BssS I（CTCGTG）。
3）切割的位置
限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，如Eco R I（G↓AATTC），常用限制性内切酶的切割序列和位点如表2-3所示。但也有在外部的如 Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等。
表2-3 几种最常用的限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶名称 | 识别序列和切割点 |
BamHⅠ | G↓GATCC |
Cla Ⅰ | AT↓CGAT |
EooR Ⅰ | G↓AATTC |
Hind Ⅲ | A↓AGCTT |
HindⅡ | GTPy↓PuAC |
KpnⅠ | GGTAC↓C |
Not Ⅰ | GC↓GGCCGC |
Pst Ⅰ | CTGCA↓G |
Sal Ⅰ | G↓TCGAC |
Sau3A Ⅰ | ↓GATC |
Sfi Ⅰ | GGCCNNNN↓NGGCC |
Sma Ⅰ | CCC↓GGG |
DXba Ⅰ | T↓CTAGA |
Xho Ⅰ | C↓TCGAG |
4）切割的方法
常用的酶切方法有单酶切、双酶切和部分酶切等几种。
（1）单酶切法，即用一种限制性内切酶切割DNA样品。若样品是线性DNA分子，完全酶切后产生n+1个DNA片段，其中有两个片段的一段仍保留原来的末端；若样品是环状DNA样品，完全酶切后，产生与识别序列（n）相同的DNA片段数，并且DNA片段的两末端相同。
（2）双酶切法，即用两种不同的限制性内切酶切割同一种DNA分子。样品DNA分子无论是线性的还是环状的，酶切后产生的DNA分子片段都带有两个不同的末端（除同尾酶酶切外）。
（3）部分酶切法，即所用的限制性内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。部分酶切的原因主要是底物DNA的纯度问题、底物DNA的甲基化程度、酶的用量、酶的活性以及反应环境等
与II型核酸内切酶有关的几个概念
粘性末端（cohesiveends）：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来（如Eco R I）。
平末端（Blunt end）：在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构，如Eco R V（GAT↓ ATC）。产生的末端的DNA可任意连接，但连接较粘性末端低。
同裂酶（isoschizomers）：是来源于不同物种的识别序列和切割为位点均相同的酶。如Hpa II与 Msp I（5′- C↓ CGG-3′）。
同尾酶（isocaudamers）：识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamH I、BclI、BglII和Xho I 是一组同尾酶。
同位酶（isoschizomer）：具有相同的识别序列，但酶切位点不同的酶。如Sma I 5′- C↓ CCGGG-3′和Xma I 5′- CCC↓GGG-3′。
注意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。
2.3.4影响限制性核酸内切酶酶解反应的因素
限制性核酸内切酶的质量控制主要包括经酶切的DNA片段重新连接后能再被识别切割、不存在其他酶的污染、对酶切的特异性识别序列具有专一性等指标，为了保证限制性内切酶的酶解效率和高保真性，基因工程操作者应了解影响酶解反应的影响因素，其主要影响因素如下：
（1）底物DNA
限制性核酸内切酶的底物是双链DNA分子（或DNA片段），其催化效率与DNA样品纯度、DNA分子结构、识别序列两侧序列长短以及识别序列碱基甲基化程度密切相关。
DNA纯度 在DNA样品中若含有蛋白质，或者没有去干净制备过程中所用的试剂，如宜春、EDTA、SDS和氯仿等，均会降低酶的催化效率，甚至不起作用，因此酶解反应保证底物DNA的纯度合乎实验要求。
DNA分子构型限制性内切酶切割线形DNA分子的效率明显高于切割超螺旋质粒DNA和环状病毒DNA的效率。
识别序列的侧面序列 大多数限制性内切酶对只含有识别序列的寡核苷酸是不具催化活性的，如仅含GAATTC的寡核苷酸不会被Eco R I切割，只有在GAATTC的两侧各延长一个或几个核苷酸，才能被Eco R I有效切割。
位点偏爱 研究发现识别序列的侧面序列的核苷酸组成与切割效率有关，这种现象称为位点偏爱。如在pBR322DNA上有Nae I的4个识别序列，在未经过特殊位点的甲基化修饰情况下，其中两个识别序列迅速切割，第3个识别序列稍缓切割，而第4个识别序列的切割效率仅为其他序列的1/15。
DNA甲基化 识别序列中的核苷酸一旦被甲基化酶甲基化，就会影响限制性内切酶的切割效率。
（2）限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的催化活性与限制性内切酶的活性、用量与其酶解温度相关。
酶的用量 酶解反应中限制性内切酶的用量主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品。在DNA样品确定后，为了完全切割此DNA样品，酶的用量视酶的催化活性耳钉，酶的活性高的用量少，反之则多。
酶解温度 大多数限制性内切酶的最适反应温度为37℃，而少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃，如Sma I的最适反应温度为25℃。
（3）限制性核酸内切酶反应缓冲液
限制性核酸内切酶的反应缓冲液中含有氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾，二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇、Tris-HCl或Tris-Ac。为提高不同限制性核酸内切酶的催化活性，摸索出了多种反应缓冲液，每种酶只有在最适的反应缓冲液中才具最强的催化活性。现在限制性核酸内切酶的反应缓冲液已商品化，操作时应按操作说明使用。
在“非最适的”的反应条件下，即高浓度的限制性核酸内切酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代 Mg2+以及高pH值等等，有些限制性核酸内切酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象称为限制性内切酶的星号活性（start activity）。用*表示。Star 活性出现的频率因采用的限制性内切酶、底物DNA和反应条件的不同而不同，几乎所有的限制酶都会出现Star 活性。因此，为了避免产生Star 活性，即使降低酶的切割效率，也要尽可能排除产生Star 活性的条件。如降低反应系统中甘油含量，控制在pH中性和高盐浓度下进行反应。
2.3.5限制性核酸内切酶的应用
1）在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶片段
2）建立DNA分子的限制酶图谱
3）构建基因文库
4）用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。
