2.4DNA连接酶

DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应形式是将DNA双链上相邻的3′羟基和5′磷酸基团共价结合形成3′，5′-磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。值得注意的是DNA连接酶并不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口（nick），即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂；而不能封闭裂口（gap），即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。

2.4.1 DNA连接酶的种类

DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

T4 DNA连接酶是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化而来。它不但能把两个具有粘性末端互补配对的DNA分子连接在一起或把一个DNA分子的两个粘性末端连接起来使之称环状，而且也能把平末端的DNA分子连接起来。因此，在基因工程中被广泛使用。

大肠杆菌DNA连接酶几乎不能催化两个平末端DNA分子的连接，它的适合底物是一条链带切口的双链DNA分子和具有同源互补粘性末端的不同DNA片段。

2.4.2 DNA连接酶的机理

T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶，除了前者用腺苷三磷酸（ATP）作为能源辅助因子，后者用烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸（NAD⁺）作为能外辅助因子外，两种酶连接催化DNA切口的连接过程基本相同。首先由NAD⁺或ATP与连接酶反应，形成腺苷酸化的酶（酶-AMP复合物），其中AMP的磷酸与酶蛋白中的赖氨酸ε-氨基以酰胺键结合。然后酶将AMP转移给DNA切口处的5′-磷酸，以焦磷酸键的形式活化，形成AP-P-DNA。随后通过相邻的3′-OH对活化的磷原子发生亲核攻击生成3′，5′-磷酸二酯键，同时释放出AMP。

2.4.3影响DNA连接酶的反应条件

影响连接酶活性的参数主要有5个，即酶浓度、反应时间、反应温度以及作用底物的DNA片段的摩尔比和DNA末端的特性（粘性末端或平齐末端）等。其中，温度的影响是最显著的。DNA连接酶的最适反应温度是37℃，但在此温度下，粘性末端处的氢键易受热破坏，而降低粘性末端结合的速率。因此，连接反应的温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般在4~15℃比较合适。除温度外，连接酶的用量与连接DNA分子的末端特性相关，在连接平末端DNA分子时，没用量为1~2单位连接效率较高；而连接粘性末端DNA分子时，酶用量为0.1单位时连接效率最佳。另外，使外源DNA片段的浓度比载体DNA浓度高10~20倍，这样可以增加不同分子间的接触机会，减少载体或外源DNA自身连接现象。