2.5DNA聚合酶
DNA聚合酶（DNA polymerase）是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA模板，并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。常用的DNA聚合酶及特性如表2-4。
表2-4常用的DNA聚合酶及特性
聚合酶名称 | 来源 | 模板 | 3′→5′ 外切活性 | 5′ →3′ 外切活性 | 聚合反应速率 | 持续合成能力 |
E.Coli DNA聚合酶 | 大肠杆菌 | DNA | 低 | 有 | 中 | 低 |
Klenow大片段酶 | 大肠杆菌 | DNA | 低 | 无 | 中 | 低 |
T4 DNA聚合酶 | T4噬菌体 | DNA | 高 | 无 | 中 | 低 |
T7 DNA聚合酶 | T7噬菌体 | DNA | 高 | 无 | 快 | 高 |
反转录酶 | 肿瘤病毒 | RNA | 无 | 无 | 低 | 中 |
Tag DNA聚合酶 | 栖热水生菌 | DNA | 无 | 有 | 快 | 高 |
这些DNA聚合酶作用的共同特点在于，他们能够把脱氧核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3′-OH端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离得情况。
这些DNA聚合酶作用的条件为：①以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物；②需要模板的指导；③需有引物（3′-OH）指示合成起点，不能自行其起始合成新的DNA链；④催化dNTP加到生长中的DNA链的3′-OH末端，DNA的合成方向是5′→3′。
2.5.1大肠杆菌DNA聚合酶I
目前，已经从大肠杆菌中分离出3种类型的DNA聚合酶，即DNA聚合酶I（Pol I）、DNA聚合酶II（Pol II）、DNA聚合酶III（Pol III）、DNA聚合酶IV、（Pol IV）DNA聚合酶V（Pol V）。在大肠杆菌中，DNA聚合酶 I、DNA聚合酶 II的主要功能为参与DNA的修复，DNA聚合酶III主要参与DNA的复制， DNA聚合酶 IV与DNA聚合酶II一起负责稳定期的损伤修复，DNA聚合酶V参与SOS修复。其中，基因工程操作中最常用的为DNA聚合酶。
DNA聚合酶Ⅰ也称Kornber酶，是1956年由Arthur Kornberg首先发现的第一个DNA聚合酶，此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。DNA聚合酶I具有三种活性：①5′→3′DNA聚合酶活性（能以单链DNA为模板，在3′-OH引物的引导下，按5′→3′方向，合成互补的DNA序列）；②3′→5′外切核酸酶活性（能够去除延长的核酸链上的3′→OH末端上的核苷酸，可以沿3′→5′方向降解双链或单链DNA，释放5′-单核苷酸）；③5′→3′外切核酸酶活性（能从DNA链5′-OH末端降解双螺旋DNA的一条链，沿5′→3′方向，释放出单核苷酸或寡核苷酸）。
DNA聚合酶Ⅰ的主要用途：①用切口平移（nick translation）方法标记DNA（如图2-1），切口平移是指当双链DNA的一条链产生缺口时，DNA聚合酶I 的5′→3′聚合活性将脱氧核苷酸添加到3′-OH端上，与此同时，其5′→3′外切酶从缺口的5′-P末端切除原有核苷酸，使切口沿着DNA平移，此即称为切口平移反应；②利用其5′→3′外切核酸酶活性降解寡核苷酸作为合成cDNA第二链的引物；③用于对DNA分子的3′突出尾进行末端标记，用于DNA序列分析。
2. 5.2 Klenow片段
Klenow片段是用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶Ⅰ产生，或通过克隆技术而获得。此酶是单一多肽链，分子量76kD。它具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，而无5′→3′外切酶活性。Klenow片段的主要用途：①补平限制性内切酶切割DNA产生的3′凹端；②用[P32]dNTP补平3′凹端，对DNA片段进行末端标记；③在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；④在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA；⑤应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序；⑥也用于PCR反应进行体外扩增基因DNA序列，但已经被TaqDNA聚合酶代替。
与切口平移法不同，DNA末端标记并不是将DNA片段的全长进行标记，而是只将其一端（5′或3′端）进行部分标记。在使用Klenow酶进行DNA末端标记时，DNA片段应具有3′凹端，因其不能直接作用于3′突出端。
2.5.3T4噬菌体DNA聚合酶
T4噬菌体DNA聚合酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，其分子量为114kD。T4噬菌体DNA聚合酶具有5′→3′聚合酶活性及3′→5′外切核酸酶活性，其3′→5′外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA的作用更强，且它的外切核酸酶活性比Klenow片段要强100~ 1000倍。它的主要用途：①补平或标记限制性内切酶消化DNA后产生的3′凹端；②对带有3′突出端的DNA分子进行末端标记；③标记用作探针的DNA片段；④将双链DNA的末端转化成为平端；⑤使结合于单链DNA模板上的诱变寡核苷酸引物得到延伸。
2.5.4T7噬菌体DNA聚合酶
T7噬菌体DNA聚合酶来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌，由两个亚基组成，即T7基因5编码的大亚基，有5′→3′聚合酶和3′→5′外切酶活性；大肠杆菌编码的小亚基，硫氧还蛋白，它能增加大亚基对模板的亲和性。因此，T7噬菌体DNA聚合酶具有持续合成能力强，3’®5’外切酶活性高（约为Klenow片段的1000倍），单链和双链都能降解，不受DNA二级结构的影响等特点，是所有已知DNA聚合酶中持续合成能力最强的一个酶。它的主要用途：①用于拷贝大分子量的DNA模板的引物延伸反应，②通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记。③将3′或5′的突出末端变成平末端。
2.5.5测序酶
测序酶是通过化学修饰或基因工程方法对T7噬菌体DNA聚合酶进行改造的酶，它不具备T7噬菌体DNA聚合酶3′→5′外切核酸酶活性，保留其聚合酶活性，具有很强的持续合成能力，是Sanger双脱氧末端终止法对长片段DNA进行测序的理想酶。
2.5.6Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶，是从嗜热的水生菌Thermusaquaticus中纯化来的，现在以基因工程生产并出售（AmpliTaqTM）。该酶具有5′→3′聚合酶活性及5′→3′外切核酸酶活性，需要Mg2+作辅助因子，最适温度为75~80℃。Taq DNA聚合酶的主要用途为在聚合酶链式反应（PCR）中对DNA分子的特定序列进行体外扩增，但其缺点是由于Taq DNA聚合酶没有3′→5′外切核酸酶活性，对PCR反应中掺入的错配碱基无法修正。
2.3.7反转录酶
反转录酶（Reverse transcripatase）是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。目前有两种反转录酶已经商品化—一种来自禽类成髓细胞瘤病毒（AMV）；另一种来自Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）。应用较多的是AMV反转录酶，它由α和β两条肽链组成，α链具有反转录酶及较强的RNase H活性，其中RNase H活性是一种核酸内切酶，它能特异地降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链；β链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5′→3′脱氧核酸外切酶活性，而无3′→5′外切功能。它的5′→3′聚合酶活性取决于有一段引物和一条模板分子的存在。
反转录酶的主要用途为：①以mRNA为模板合成cDNA；②利用其的5′→3′外切酶，标记带的5′突出末端的DNA片段。
