直接分离法

限制性内切酶酶切分离法

限制性内切酶酶切分离法适用于从简单的基因组中分离目的基因，如质粒或病毒的大小只有几千碱基，大的也超不过几十万碱基，编码基因比较少，获得也比较简单。

（1）对已定序列的DNA分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。

（2）对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。

（3）即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从中钩出目的基因。

利用酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因

    酶促反转录主要用于合成分子量较大，转录产物mRNA易分离的目的基因。这种方法以目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成互补的DNA，即cDNA，然后再DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段，与适当的载体重组后转入受体菌扩增，获得目的基因的cDNA克隆。哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白mRNA的比例占总mRNA量的90%以上，这样就可以通过mRNA    cDNA     dscDNA的途径建立cDNA文库获得珠蛋白基因。

机械方法

    利用机械力将DNA片段化。例如超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断；1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。

物理化学法

DNA分子的两条链存在着G≡C、A＝T碱基配对，其中GC间存在3个氢键、AT间存在2个氢键，如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。如（1）密度梯度离心法，由于富含碱基GC的双链DNA片段浮力密度较大，利用精密的密度梯度超速离心技术可使切割成适当片段的不同DNA按密度大小分离开来。然后通过与某种放射性的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。非洲爪瞻5S DNA和海胆组蛋白基因就是根据此分离得到；（2）单链酶解法，DNA分子中某基因片段GC碱基含量高，则其热稳定性高，即其解链温度（Tm）值就高。据此，可以通过控制解链温度使富A=T区变性解链，而富G≡C区的DNA的片段。海胆rDNA分子内GC含量可高达63%，通过热变性和S1酶解处理可得到提纯50倍的rDNA。