重组子的构建 Construction of recombinons

DNA的体外重组是将目的基因重组到合适的载体上，这种重新组合的DNA称为重组DNA或重组子。为何必须将目的基因重组到载体上呢？这是因为一般的DNA片段因不含复制所需的序列信息（复制起始位点），即便进入宿主细胞内，仍然不能进行增殖甚至被稀释掉。因此，DNA片段必须同能够自我复制的DNA分子（如质粒或噬菌体等）连接成为重组DNA分子，通过转化或其他途径导入宿主细胞中，实现目的基因的复制、表达或最终整合到宿主细胞基因组中获得转基因生物。

外源DNA片段同载体分子的连接主要依赖于核酸限制性内切酶、DNA连接酶和其他修饰酶的作用。在选择外源DNA片段同载体分子的连接反应程序时，一般考虑如下几点（1）实验步骤尽量简单易行；（2）连接形成的“接点”序列应该能被一定的内切酶消化，比便回收目的DNA序列；（3）保证目的基因按正确的转录方向插入到载体中，并保证翻译过程中密码结构的阅读不发生移位。

1. 重组子的连接方式

1.1 相同黏性末端连接

在DNA分子连接操作中，相同黏性末端最适合于DNA片段的连接。如果外源DNA和载体DNA均用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解，只要两种DNA分子均含有相同的黏性末端，混合后它们就能顺利连接为一个重组DNA分子。经单酶处理的外源DNA片段在重组分子中可能存在正反两种方向，而经两种非同尾酶处理的外源DNA片段只有一种方向与载体DNA重组。上述两种重组分子均可用相应的限制性内切酶重新切出外源DNA片段和载体DNA，克隆的外源DNA片段可以原样回收。而经两种同尾酶分别切割的外源DNA片段和载体DNA，由于产生的黏性末端相同也便于连接，但是克隆的外源DNA片段一般不可以原样回收。

1.2不同黏性末端的连接

具有不同黏性末端的DNA序列无法直接相连，可以将两者转变成平末端后再进行连接。但这种做法有其缺陷，主要有以下几种影响：使重组的DNA分子增加或减少几个碱基对；破坏原来的酶切位点，使已重组的外源DNA片段无法回收；如果连接位点在基因编码区，那么连接后会改变阅读框，使相关基因无法正确表达。因此不同黏性末端DNA片段的连接要根据具体情况选择不同的连接方法。

不同黏性末端之间的连接主要有以下四种方式：

（1）待连接的DNA片段都有5′单链突出末端。这种情况下，可以在连接反应前使用S1核酸酶将两者5′单链突出端切除，或使用Klenow酶补平，然后将两平末端连接。前一种方法产生的重组DNA会少掉几对碱基，而后一种的重组DNA较连接前没发生碱基对的变化。

（2）待连接的DNA片段都有3′单链突出末端。可使用T4聚合酶将两者3′单链突出末端切除，然后将产生的平末端连接。这种方法产生的重组DNA较连接前会减少几对碱基。需要指出的是，Klenow酶不具有补平3′单链突出末端的活性。

（3）一种待连接的DNA片段具有3′单链突出末端，另一种具有5′单链突出末端。可以使用Klenow酶补平5′单链突出末端，同时用T4聚合酶切除3′单链突出末端，然后将产生的平末端连接。

（4）待连接的两种DNA片段均含有不同的两个黏性末端。可以首先用Klenow酶补平DNA片段的5′单链突出末端，再用T4DNA聚合酶切除其3′单链突出末端，然后将产生的平末端连接。

1.3 平末端连接

    如果外源DNA分子不是平末端，则通过以下两种方式获得平末端：一种是用产生平末端的限制性内切酶（如EcoRV、SmaI）消化获得DNA片段；另外一种是用Klenow聚合酶补平或S1核酸酶切平获得平末端DNA片段。同样载体多克隆位点有产生平末端的限制性内切酶识别位点，则用该酶切割，否则就用上述手段获得具有平末端的载体。

通过以上途径获得的具有平末端的外源DNA和载体DNA可以进行平末端连接。和黏性末端的连接相比，平末端的连接效率仅为黏性末端的1%~10%。提高平末端连接效率的措施为：（1）增加连接酶用量，通常使用黏性末端连接用量的10倍；（2）增加DNA平头末端的浓度，提高平头末端之间碰撞的概率；（3）加入NaCl或LiCl以及PEG；（4）适当提高连接反应温度，平头末端连接与退火无关，适当提高反应温度既可以提高底物末端或分子之间的碰撞概率，又可增加连接酶的反应活性，一般选择20~25℃较为适宜。

1.4 修饰黏性末端连接

   黏性末端连接具有重组效率高，外源DNA片段可定向插入并通过酶切释放插入DNA片段的优点。因此，在很多情况下将不同末端的载体或外源DNA片段修饰成黏性末端，以便高效的黏性末端连接。

    常见需要修饰的黏性末端情况包括（1）载体与外源DNA分子没有匹配的末端进行有效连接；（2）外源DNA是随机切割的基因组DNA或逆转录合成的cDNA等，就需要根据所选的载体DNA分子的克隆位点，有针对性地将外源基因组DNA片段或cDNA进行末端修饰，以便克隆。

2. 重组子的连接结果（讨论）

3. 影响外源DNA片段与载体DNA连接反应的因素

载体与外源DNA片段体外连接重组时，其连接效率不仅受DNA末端性质的影响（如黏性末端或平末端），同时受反应温度、外源DNA片段和载体DNA之间的摩尔比、反应时间、ATP等反应条件的影响。

连接反应的温度是比较重要的影响因素。因为连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下仅含4~6bp的退火黏性末端之间的氢键结合不稳定（Tm≤15℃），不足以抗拒热运动的破坏。因此，连接温度应介于酶的最适温度和黏性末端退火温度之间，一般为4~22℃。平末端连接温度要更低些。退火黏性末端之间的连接可视为分子内的连接，而平末端之间为分子间的连接。从分子动力学角度讲，后者更为复杂且速度也要慢得多，因此，平末端的连接效率要低一些，仅为黏性末端的1%~10%。一般黏性末端连接反应为16℃、12h或22℃、4~5h，而平末端连接反应为4~8℃、12h.

外源DNA片段和载体DNA之间的摩尔比经验值为3~10，即外源DNA片段多于载体DNA数，这样有利于提高重组率。

连接酶用量一般为0.1~2U，平末端连接酶用量要高一些。ATP浓度一般为10μmol/L~1mmol/L，但载体环化受ATP浓度影响较大，当ATP浓度为0.1 mmol/L时环化程度最大。在反应缓冲液中加一定浓度PEG可以提高连接效率。

修饰的常用方式有同聚物加尾、衔接物或接头分子、PCR法引入酶切位点等几种。