重组子的筛选与鉴定 Screening and identification of recombinants
在DNA分子克隆中，通常将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子（transformant），而含有重组DNA分子的转化子被称为重组子（recombinant）。如果重组子中含有外源目的基因则又称为目的重组子或期望重组子。
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被重组DNA分子导入。相对数量极大的受体细胞而言，仅有少数外源DNA分子能够进入，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳外源DNA分子之后能稳定增殖为转化子。
转化子相对某种特定重组子又成为数量巨大的群体。在大量的转化子中，会接纳多种类型的DNA分子，包括（1）不带任何外源DNA插入片段，仅是由线性载体分子自身连接形成的环状DNA分子；（2）由一个载体分子和一个或数个外源DNA片段构成的重组DNA分子；（3）单纯由数个外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子。当然最后这类多聚DNA分子不具备复制基因和复制起始位点，不能在转化子中长期存留，最终由于细胞分裂被消耗掉成为无用分子。尽管如此，面对这种混合的DNA制剂转化来的大量克隆群体，需要采取一套行之有效的方法，筛选出可能含有外源DNA片段的重组体克隆，然后用特殊的方法鉴定含有目的基因的期望重组子。
1.表型筛选法
表型筛选法就是在宿主菌（如大肠杆菌）中表达目的基因，是宿主产生新的表型或使宿主恢复其突变基因的表型来筛选目的基因。常用的表型筛选法如下：
1.1抗药性筛选法
抗药性筛选主要用于重组质粒DNA转化子的筛选。因为质粒DNA分子携带特定的抗药性标记，转化受体菌后能使后者在含有相应选择药物的培养基上正常生长，而不含质粒DNA分子的受体菌则不能存活。这是一种正向选择方式。
人工构建的质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体一般都带有1~3个抗药性基因作为选择标记。载体中常用的抗性标记有氨苄青霉素（ampicillin，Ap 或Amp）、四环素（tetracycline，Tet）、氯霉素（chloramphenicol，Cn或Cmp）和卡那霉素（kanamycin，Kn）等。
pBR322质粒是分子克隆中最常用的一种载体分子，编码tetr和ampr，使带有该质粒的宿主细胞能在含有四环素或氨苄青霉素的培养基中生长。在pBR322质粒的tet r基因内有Bam H I和Sal I 两种限制性内切酶的单一识别位点可供外源DNA的插入，这两个位点中任何一个一旦有外源DNA的插入，都会导致tet r基因出现功能性失活，于是形成的重组体转化子将具有Tets Ampr的表型。将此转化菌先涂布在含有氨苄青霉素的平板上，并将存活的菌落原位影印到另一个含有四环素的平板上，凡是在氨苄青霉素平板上生长，而在四环素平板上不生长的菌落，就可能获得了这种重组体质粒的转化子克隆。应该说，抗药性筛选只是初步筛选，如果要确定重组子还需进一步鉴定。
使用抗药性筛选一般要做好两个对照。一个是以受体菌涂布在选择平板上，同步保温培养后不应长出菌落即阴性对照（空白），用以证明受体菌的纯度、抗生素的有效性和操作方法的可靠性。另一个是将载体转化感受态细胞后，涂布选择平板，经同步保温后应长出菌落即为阳性对照，用以证明感受态细胞的制备、转化操作过程、抗生素使用浓度等是正确可靠的。只有建立在空白与阳性对照结果明确和认真分析的基础上，进行转化子的抗性筛选才有意义。
1.2 营养缺陷型筛选法
如果载体分子上携带某些营养成分（如氨基酸或核苷酸等）的生物合成基因，而受体细胞因该基因突变不能合成这种生长所必须的营养物质，则两者构成了营养缺陷性的正选择系统，将待筛选的细菌涂布在缺少该营养物质的合成培养基上，长出的菌落即为转化子，而重组子的筛选仍需要第二个选择标记，并通过插入灭活的方式进行第二轮筛选。营养缺陷型的筛选过程同样存在着受体细胞的回复突变问题，因而需要对获得的转化子作进一步的鉴定。
1.3 插入效应筛选
插入效应筛选主要利用外源DNA片段与载体的特定结构部位连接后，引发载体相关功能的改变，为重组子的筛选提供信息。常用的有插入失活法、插入表达法和噬菌斑形成筛选法。
（1）插入失活法（insertionalinactivation）
插入失活法是检测外源DNA插入作用的一种通用方法。插入失活指的是外源DNA插入载体的抗药性标记基因序列中，导致该基因结构破坏而失活，使细胞丧失对抗生素抗性的功能，如pBR322质粒载体，可通过宿主细胞的Tet和Amp表型检测重组体。
利用插入失活效应筛选，需要点种或影印到两个不同抗性的平板上对比菌落生长状况。如上述的Tets Ampr表型细胞的筛选，只有在Amp平板上生长而在Tet平板上不能生长的菌落，才可能是重组质粒的转化子。这样对比平板上的菌落是很麻烦的一部，容易造成菌落遗漏或混杂，若把转化的细胞接种在加有环丝氨酸和四环素的培养基上生长，会简化这种插入失活筛选法的程序。这是由于环丝氨酸和四环素对细胞的作用效果各不相同，环丝氨酸会使生长的细胞致死，而四环素仅仅是抑制Tets细胞的生长而非致死。因此，接种在含有环丝氨酸和四环素培养基中的Tetr细胞，由于对四环素有抗性能够生长，而被培养基中的环丝氨酸杀死；Tets细胞的生长受到抑制，从而避免了环丝氨酸的致死作用，存活下来。将经过如此处理的细胞，涂布在含有氨苄青霉素的琼脂平板上，能够生长形成Tets Ampr表型菌落的，基本上都是带有外源DNA插入片段的pBR322质粒分子。
（2）插入表达筛选法
插入表达效应与插入失活效应的表型特征正好相反，插入表达是利用外源DNA片段插入特定载体后能激活标记基因的表达，利用标记基因表达产物的功能或信号进行转化子的筛选。这类载体在构建时将一段负调控序列重组到标记基因上游用于抑制载体标记基因的表达。当外源DNA插入在负调控序列内使其失活时，位于下游的标记基因才能表达。pTR262质粒载体由pBR322衍生而来，其Tetr基因的上游含有一段λ噬菌体DNA的cI阻遏蛋白及其调控序列，cI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tetr基因的表达。当外源DNA片段插入位于cI基因序列中的Hind III 或Bgl I位点时，cI基因失活，不能产生活性的阻遏蛋白，使四环素抗性基因解除抑制而表达，菌体呈现对四环素的抗性。故阳性重组子带给细胞为Tetr表型。当转化细菌涂布在Tet平板上时，只有含外源DNA片段的重组子转化菌才能生长成菌落。
插入失活法或插入表达法筛选出来的克隆并不完全是含有目的基因的重组体。由于所使用的试剂质量（如限制性内切酶和连接酶活性与纯度）或操作方面的问题，自身环化的载体分子有时也会失去特定的遗传标记。尽管如此，作为初级筛选，插入失活或插入表达筛选无疑是一种简便快速的方法，使后续鉴定调高了效率，减少了工作量和盲目性。
1.4 β-半乳糖苷酶显色反应选择法
许多大肠杆菌的载体质粒上含有lacZ′标记基因，它包括大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列以及氨基酸端146个氨基酸残基的编码序列，其表达产物为无活性的不完全酶，称为α受体。而许多大肠杆菌的受体细胞在其染色体DNA上含有β-半乳糖苷酶羧基端的部分编码序列，尤其产生的蛋白质也无酶活性，但可作α供体。无论在胞内还是胞外，受体一旦与供体结合，便可恢复β-半乳糖苷酶的活性，将无色的5-溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖（X-gal）底物水解成蓝色产物，这一现象称为α互补。
当外源DNA片段插到位于lacZ′基因内部的多克隆位点时，生长在含有X-gal的平板上的重组子因lacZ′基因的插入失活而呈白色，非重组子则显蓝色。有些大肠杆菌质粒（如pUC18/19）的标记基因为lacl′-lacOPZ′，其编码阻遏蛋白l的基因lacl是缺失的，因而不能在受体菌中合成具有操纵子lacO结合活性的阻遏蛋白，lacZ′基因得以全程表达，筛选时只需要在培养基中添加X-gal即可。另一些大肠杆菌质粒如Psport1，携带完整的lacl基因，能在受体菌中产生阻遏物，后者结合在相应的操作子上并关闭lacZ′，此时在筛选培养中必须同时添加X-gal和诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），才能根据颜色反应筛选重组子。显色标记基因通常只用于筛选重组子，而转化子的选择主要利用抗药性标记或营养缺陷性标记，上述两种质粒除了lacZ′外都含有Amp′选择标记基因。
1.5 噬菌斑筛选法
以λDNA载体克隆基因，多用体外包装形成完整的噬菌体颗粒转导寄主细胞的方法。当外源DNA片段插入λ噬菌体载体后，其构成的DNA分子大小必须在野生型λDNA长度的75%~105%范围内，才能在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒。经转导寄主细胞后，转化子在培养平板上被裂解形成清晰的噬菌斑，而非转化子（未感染）细胞能正常生长，二者很容易区分。如果在重组过程中使用的是替换性λ载体，则噬菌斑中的λ噬菌斑即为重组子。因为空载的λDNA分子太小不能被包装，难以进入受体细胞产生噬菌斑，所以对替换型载体而言，经体外包装转导后能否形成清晰噬菌斑这本身是一种可利用的选择标记。如果使用插入行λ载体，由于空载的λDNA大于包装下限，也能被包装成噬菌体颗粒并产生噬菌斑，此时筛选重组子可以利用λ载体上的标记基因，如lacZ等。当外源DNA片段插入lacZ
基因内时，重组噬菌斑物色透明，而非重组噬菌斑则呈蓝色。
2.结构分析法
DNA的重组过程必然伴随着分子结构的变化。依据结构的特征分析筛选重组子也是一条重要途径。通过电泳观察、限制性酶谱分析、PCR扩增检测等技术，均可以通过结构变化特征确定重组子克隆。但由于这些技术基本上是对转化子个体操作，更适合小批量转化子或在初筛基础上进一步对重组子的检测与鉴定。
2.1 凝胶电泳检测法
分离质粒的DNA并测定其分子长度是证明重组体质粒分子质量增加的直接方法。由于质粒DNA的电泳迁移率与其分子量大小成比例，所以那些携带外源DNA插入序列、分子量较大的重组DNA在凝胶中的迁移率比不具有外源DNA插入序列、分子量较小的质粒DNA 慢。根据这种差别就可鉴定出哪些菌落的载体中含有外源DNA片段。
2.2 R环检测法
R环检测法是一种用于鉴定双链DNA分子中含有与特定RNA分子同源区段的方法。在临近双链DNA变性温度下和高浓度的70%甲酰胺溶液中，双链的DNA-RNA分子要比双链的DNA-DNA分子更加稳定，因此，将特异RNA探针与待测双链DNA分子的混合物置于这种复性条件下，如果RNA探针与双链DNA分子具有同源互补序列，则RNA便会取代双链DNA分子的一条链而与另一条DNA单链中的同源互补序列复性形成稳定的DNA-RNA杂交分子，而被取代的DNA链则处于单链状态。这种由双链DNA-RNA分子与单链DNA分支共同形成的“泡状”结构，叫做R环结构（图6-7）。R环结构十分稳定，并可以在电子显微镜下观察，据此可以鉴定出重组DNA，并能进行RNA与DNA同源序列的定位。
3.限制酶谱分析筛选
限制酶谱分析适用于转化子中期望重组子比率高的菌落群，或进一步分析鉴定重组子，并能判断外源DNA片段的插入方向及分子质量大小等。其基本操作是从转化菌中随机挑选出少数单菌落，分别快速提取质粒DNA，然后用一种或多种限制性核酸内切酶酶解，并通过凝胶电泳分析酶切谱带用以确定是否有外源DNA片段插入及其插入方向等。
4．PCR扩增鉴定筛选
PCR法以其快速、灵敏被广泛用于转化子的筛选。在PCR扩增鉴定中，引物设计尤为重要。鉴定用引物既可以是外源插入基因的特异序列，也可以是载体多克隆位点两侧的序列（如T7、T3、SP6启动子序列等）。采用插入基因特异引物可直接筛选出目的克隆，而用载体多克隆位点两侧序列为引物可以得到插入片段长度的信息。PCR对模板的纯度要求不高，因此可以直接用菌落裂解后的提取液扩增，而不用进一步提取质粒再扩增筛选。现在所用的载体绝大多数都是人工构建已知序列的，有些载体的多克隆位点两侧序列已成为通用型引物被广泛应用。如pGEM系列载体的多克隆位点两侧分别是SP6和T7启动子序列，依据两个启动子序列设计引物，提取少量待检转化子质粒DNA为模版，通过对PCR产物的电泳分析就可以确定是否为重组子菌落。PCR扩增方法不但可以快速获得插入片段，而且可以直接进行DNA序列分析，从而获得插入片片断是否正确的最终结果。
5. 目的克隆的鉴定
经过初步筛选获得的阳性克隆，下一步必须对带有目的序列的克隆做进一步筛选和鉴定。鉴定一般有几种常用方法：（1）分子杂交；（2）免疫学检测；（3）DNA测序。
5.1分子杂交
双链DNA在一定条件下能够变性和复性，这成为DNA杂交技术的基础。DNA杂交技术主要有菌落原位杂交、Southern杂交和Northern杂交等。
杂交的主要目的是为了检测出同源DNA序列，而为了达到这一目的，必须要有标记的探针。带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。标记探针的策略多种多样，但最终目的都是用标记的核酸代替DNA或RNA上原有的核苷酸。下面介绍两种常用的探针标记法：①切口平移标记。控制DNase I的浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3′-OH末端（这条链即成为引物）和5′-P末端。DNA聚合酶I结合到这个双链DNA的切口处，它的5′ 3′的核酸外切酶活性将DNA一条链的核苷酸一个一个的切除，同时暴露出另一条单链DNA。这条DNA链可以作为合成DNA的模板，DNA聚合酶I的5′ 3′的DNA聚合功能把一个个带有标记物的dNTP加在那个引物链的3′-OH末端，其结果使一条DNA的切口从左到右沿着DNA平移，这就叫切口平移（nick translation）(图6-9)；②随机引物标记。能与任何DNA模板的多个位点配对互补的多个不均一的序列寡聚核苷酸DNA片段叫随机引物。DNA聚合酶Klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。随机引物标记法比切口平移标记法的优越性表现为简单，而且条件易于控制，同时探针长度较为均一，杂交重复性好，这是因为随机引物标记仅需要一种酶。
5.2免疫学检测
如果能得到目的基因产物对应的抗体，就可以通过免疫学方法来筛选。免疫学检测的基本原理及操作程序与菌落原位杂交非常相似，只不过后者是用核酸探针通过碱基互补形式特异性杂交目的DNA序列，而后者利用抗体通过特异性免疫反应搜寻目标蛋白质，因此使用免疫学法筛选鉴定期望重组子的前提条件是外源基因在受体细胞中必须表达出具有正确空间构象的蛋白产物，同时应具备与之相对应的特异抗体。其操作程序包括：（1）将硝酸纤维素薄膜或CNBr活化纸片覆盖在待检测的菌落平板上，制成影印件；（2）利用氯仿气体或烈性噬菌体的汽溶胶处理影印薄膜，裂解菌落，释放包括外源基因表达产物在内的细胞内含物，此时各种蛋白质分子均原位吸附在薄膜或纸片上；（3）经固定处理后的薄膜或纸片与含有目标蛋白对应抗体的溶液保温一段时间，使抗原（待检测蛋白）与抗体发生特异性免疫结合反应；（4）洗去薄膜未特异性结合的抗体分子，再与事先用同位素125I标记的第二种抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白溶液进行第二次保温，这种放射性的抗体或蛋白分子特异地与抗原-抗体复合物中的第一种抗体结合，并指示出抗原所在的位置；（5）最后将薄膜感光X线胶片，并根据感光斑点位置在原始平板上挑出相应的期望重组子克隆。
免疫学检测远比探针原位杂交复杂，它需要使用两种不同的抗体。第一种抗体必须具有与待检测蛋白质特异性结合作用，但在大多数情况下，这种抗体很难通过免疫血清的方法获得足够多的数量用于同位素直接标记。因此，通常的做法是将第一种抗体与一种特定的蛋白质用戊二醛交联，而这种特定蛋白质相应抗体的制备方法相当成熟，如兔血清蛋白与第一种抗体结合后，所形成的杂合蛋白能特异性地识别第二种抗体—羊抗兔血清蛋白抗体。
5.3 DNA序列测定
DNA序列测定即核酸DNA分子一级结构的测定，该技术对重组DNA分子是否含有目的基因或目的基因序列是否正确提供了直接的依据，也对目的基因进一步的表达和功能研究提供了重要的前提条件。目前测序技术主要有双脱氧链终止法和化学降解法，它们在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸，然后再变性的PAGE胶上电泳检测，从而获得DNA序列。
