饲养、生产、经营、屠宰、加工、运输家畜及其产品的单位和个人,发现家畜传染病或疑似传染病时,必须立即报告当地家畜防疫检疫机构或乡镇畜牧兽医站。特别是可疑为口蹄疫、高致病性禽流感、炭疽、狂犬病、牛瘟、猪瘟、鸡新城疫、牛流行热等重要法定传染病时,一定要迅速向上级有关部门报告,并通知邻近单位及有关部门注意预防工作。上级机关接到报告后,除及时派人到现场协助诊断和紧急处理外,根据具体情况逐级上报。若为紧急疫情,应以最迅速的方式上报有关领导部门。
当家畜突然死亡或怀疑发生传染病时,应立即通知兽医人员。在兽医人员尚未到场或尚未作出诊断之前,应采取下列措施:将疑似传染病病畜进行隔离,派专人管理;对病畜停留过的地方和污染的环境、用具进行消毒;完整保留病畜尸体;不得随便急宰,不许食用病畜的皮、肉、内脏。应经常向群众宣传这些知识,解释其中的道理,使之家喻户晓。
家畜传染病发生后,及时而正确的诊断是防制工作的关键和首要环节,它关系到能否正确制定有效的控制措施。正确的诊断来自正确的策略、完善的方案、可靠的方法和先进成熟的技术,特别是对大的疫情,应该全面系统掌握各方面的材料、信息、数据和检测结果。诊断家畜传染病的方法很多,大体可分为两类,即现场诊断和实验室诊断。现场诊断又叫临诊综合诊断,包括流行病学诊断、临诊诊断和病理解剖学诊断;实验室诊断包括病理组织学诊断、病原学诊断和免疫学诊断等。尽管诊断方法很多,但任何一种诊断方法都有其不足或局限性,尤其是在特异性和敏感性方面都不可能达到完美无缺。加之每种诊断方法所针对的材料对象及其所得结果的价值和意义也不相同,而且每种传染病的特点各有不同,因此在实际工作中特别强调综合诊断,注意各种诊断方法的配合使用、各种诊断结果的综合分析,最后做出确诊。同时,尽管诊断方法很多,并非对每种病或每次诊断都要采取所有方法,而是根据具体情况和实际需要选取合适的诊断方法,有时仅需采用其中的少数几种方法即可。现将各种诊断方法简介如下。
1.临诊综合诊断
1)流行病学诊断 流行病学诊断是针对患病动物群体、经常与临诊诊断联系在一起的一种诊断方法。某些家畜疫病的临诊症状虽然非常相似,但其流行特点和规律却差别很大。例如口蹄疫、水疱性口炎、水疱病和水疱性疹等病,在临诊症状上几乎是完全一样的,无法鉴别,但从流行病学方面却不难区分。对有些传染病有时甚至仅靠流行病学诊断即可锁定疾病的大致范围,得出初步诊断。因此,这种方法在传染病的诊断工作中具有极大的实用价值,应牢固掌握。但初学者却往往容易忽视这种方法,应引起重视。
流行病学诊断是在流行病学调查(即疫情调查)的基础上进行的。疫情调查可在临诊诊断过程中进行,如以座谈方式向畜主或相关知情人员询问疫情,或对现场进行仔细观察、检查,取得第一手资料,然后进行综合归纳、分析处理,作出初步诊断。流行病学调查的内容或提纲按不同的疫病和要求而制定,一般应弄清下列有关问题。
①本次流行的情况 最初发病的时间、地点,随后蔓延的情况,目前的疫情分布。疫区内各种家畜的数量和分布情况、发病家畜的种类、数量、年龄、性别,疫病传播速度和持续时间等等。本次发病后是否进行过诊断,采取过哪些措施,效果如何。动物防疫情况如何,接种过哪些疫苗,疫苗来源、免疫方法和剂量、接种次数等。是否做过免疫监测,动物群体抗体水平如何。发病前有无饲养管理、饲料、用药、气候等变化或其他应激因素存在。查明其感染率、发病率、病死率和死亡率。
②疫情来源的调查 本地过去曾否发生过类似的疫病,何时何地发生,流行情况如何,是否经过确诊,有无历史资料可查,何时采取过何种防治措施,效果如何;如本地未发生过,附近地区曾否发生过;这次发病前,周边地区有无疫情;曾否由其他地方引进家畜、畜产品或饲料,输出地有无类似的疫病存在;是否有外来人员进入本场或本地区进行参观、访问或购销等活动,等等。
③传播途径和方式的调查:本地各类有关家畜的饲养管理制度和方法,使役和放牧情况;牲畜流动、收购以及防疫卫生情况;交通检疫、市场检疫和屠宰检验的情况;死病畜处理情况;有哪些助长疫病传播蔓延的因素和控制疫病的经验;疫区的地理、地形、河流、交通、气候、植被和野生动物、节肢动物等的分布和活动情况,它们与疫病的发生及蔓延传播之间有无关系等等。
④该地区的政治、经济基本情况,群众生产和生活活动的基本情况和特点,畜牧兽医机构和工作的基本情况,当地领导、干部、兽医、饲养员和群众对疫情的看法如何等。
综上所述,可以看出,疫情调查不仅可给流行病学诊断提供依据,而且也能为拟定防治措施提供依据。
2) 临诊诊断 临诊诊断是最基本的诊断方法。它是利用人的感官或借助一些最简单的器械如体温计、听诊器等直接对病畜进行检查,一般来说,都是简便易行的方法,有时也包括血、粪、尿的常规检验。检查内容主要包括患病动物的精神、食欲、体温、脉搏、体表及被毛变化、分泌物和排泄物特性、呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统、神经系统、运动系统及五官变化等。由于许多传染病都具有独特的症状,因此对于这些具有特征临诊症状的典型病例如破伤风、狂犬病、放线菌病、马腺疫、猪气喘病等,经过仔细的临诊检查,一般不难作出诊断。
但是临诊诊断有其一定的局限性,特别是对发病初期尚未出现有证病意义的、特征症状的病例,或症状相似病例,或非典型病例(如无症状的隐性患者),依靠临诊检查往往难于作出诊断。在很多情况下,临诊诊断只能提出可疑疫病的大致范围,必须结合其他诊断方法才能作出确诊。在进行临诊诊断时,应注意对整个发病畜群所表现的综合症状加以分析判断,不要单凭个别或少数病例的症状轻易下结论,以免误诊。
3) 病理解剖学诊断 患传染病而死亡的家畜,尸体多有一定的病理变化,有些病如猪瘟、猪气喘病、鸡新城疫、禽霍乱、牛肺疫等还有特征性的病理变化,具有很大的诊断价值,可作为诊断的依据之一。因此, 病理解剖学检查是诊断传染病的重要方法之一。它既可验证临床诊断结果的正确与否,又可为实验室诊断方法和内容的选择提供参考依据。
病理解剖学诊断主要是检查肉眼病变或叫大体病变,病理剖检应由兽医人员在规定的地点和场所来完成,不可任意随地剖检,以免造成污染,散播疾病。如果怀疑炭疽时则严禁剖检。作病理解剖检查时应注意操作顺序,先观察尸体外观变化,包括有无尸僵出现、被毛及皮肤变化;天然孔有无分泌物、排泄物和出血及其性质;体表有无肿胀或异常;四肢、头部及五官有无变化等等。然后检查内脏,先胸腔再腹腔;先看外表(浆膜)再切开实质脏器和浆膜;先检查消化道以外的器官组织,最后检查消化道,以防消化道内容物溢出而影响观察并造成污染。检查时注意实质脏器如心、肝、脾、肺、肾、胃、胰、胸腺、膀胱、子宫、卵巢、睾丸、喉头、气管、食道、淋巴结、输卵管、输尿管、肠浆膜等有无炎症、水肿、出血、变性、坏死、萎缩、肿瘤等异常变化。对家禽还应注意观察气囊和法氏囊。由于每种传染病的所有病理变化不可能在每一个病例身上都充分表现出来,因此应剖检尽可能多的病例。有的病畜,特别是最急性死亡的病例、非典型病例和早期屠宰的病例,往往缺乏特征性的病变,因此应选择症状较典型、病程长的、未经治疗的自然死亡病例进行剖检。
2. 实验室诊断
1)病理组织学诊断 病理组织学诊断是观察组织学病变或叫显微病变。有些疫病引起的大体病变不明显或缺如,仅靠肉眼很难作出判断,还需作病理组织学检查才有诊断价值,例如传染性海绵状脑病和肿瘤等。有些病还需检查特定的组织器官,如疑为狂犬病时应取脑海马角组织进行包涵体检查。
2)微生物学诊断 微生物学诊断属于病原学诊断的范畴,是诊断家畜传染病的重要方法之一。常用诊断方法和步骤如下:
①病料的采集 正确采集病料是微生物学诊断的重要环节。病料力求新鲜,最好能在濒死时或死后数小时内采取;应从症状明显、濒死期或自然死亡而且未经治疗的病例取材;要求尽量减少杂菌污染,用具器皿应尽可能严格消毒。通常可根据所怀疑病的类型和特性来决定采取哪些器官或组织。原则上要求采取病原微生物含量多、病变明显的部位,同时易于采取,易于保存和运送。如果缺乏临诊资料,剖检时又难以分析诊断可能属何种病时,应比较全面地取材,例如血液、肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等,同时要注意带有病变的部分。如怀疑炭疽,则按规定方法取材。
②病料涂片、镜检 通常把有显著病变的组织器官涂片数张,进行染色、镜检。此法对于一些具有特征性形态的病原菌如炭疽杆菌、巴氏杆菌等可以迅即做出诊断,但对大多数传染病来说,只能提供初步依据或参考。
③分离培养和鉴定 用人工培养方法将病原体从病料中分离出来。分离培养细菌、真菌、螺旋体等可选择适当的人工培养基,分离培养病毒可选用禽胚、动物或细胞组织等。分得病原体后,再进行形态学、培养特性、动物接种、免疫学及分子生物学等鉴定。
④动物接种试验 通常选择对病原体最敏感的动物进行人工感染试验。将病料用适当的方法处理并进行人工接种,然后根据对动物的致病力、症状和病理变化特点来帮助诊断。当实验动物死亡或经一定时间剖杀后,观察体内变化,并采取病料进行涂片检查和分离鉴定。
一般常用的实验动物有家兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、家禽、鸽子等,当实验动物对病原体无感受性时,可以采用有易感性的本种动物进行试验,但费用高,而且需要严格的隔离条件和消毒设施,因此只有在必要和条件许可时才进行本种动物接种试验。
从病料中分离出病原微生物,虽是确诊的重要依据,但也应注意动物的“健康带菌(毒)”现象,其结果还需与临诊及流行病学、病理变化结合起来进行综合分析。有时即使没有发现病原体,也不能完全否定该种传染病的诊断,因为任何病原学方法都存在有漏检的可能。
3)免疫学诊断 免疫学诊断是传染病诊断和检疫中最常用、最重要的诊断方法之一,它包括血清学试验和变态反应两大类方法。
①血清学试验 可以用已知抗原来测定被检动物血清中的特异性抗体,也可以用已知的抗体(免疫血清)来测定被检材料中的抗原。免疫学方法检测的抗原可以是完整的病原体,也可以是病原体的一部分。根据实验原理,血清学试验可分为中和试验(毒素抗毒素中和试验、病毒中和试验等)、凝集试验(直接凝集试验、间接凝集试验、间接血凝试验、协同凝集试验和血细胞凝集抑制试验)、沉淀试验(环状沉淀试验、琼胶扩散沉淀试验和免疫电泳等)、溶细胞试验(溶菌试验、溶血试验)、补体结合试验以及免疫荧光试验、免疫酶技术、放射免疫测定、单克隆抗体等。近年来因其与现代科学技术相结合,血清学试验发展很快,在方法改进上日新月异,应用也越来越广,已成为传染病快速诊断的重要工具。
②变态反应 动物患某些传染病(主要是慢性传染病)后,可对该病病原体或其产物(某种抗原物质)的再次进入产生强烈反应,即变态反应。能引起变态反应的物质(病原体或其产物或抽提物)称为变态原,如结核菌素、鼻疽菌素等,将其注入患病动物时,可引起局部或全身反应,故可用于传染病的诊断。
4)分子生物学诊断 分子生物学诊断又称基因诊断。主要是针对不同病原微生物所具有的特异性核酸序列和结构进行测定。自1976年以来,基因诊断方法取得巨大进展。建立了DNA限制性内切酶图谱分析、核酸电泳图谱分析(如鸡传染性法氏囊病毒、呼肠孤病毒等都有特征性电泳图谱条带)、寡核苷酸指纹图、核酸探针(northern杂交,Southern杂交,原位杂交、斑点杂交等)、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、Western杂交以及新近几年发展起来的DNA芯片(DNA Chip)技术等。在传染病诊断方面,具有代表性的技术主要有三大类:PCR技术、核酸探针和DNA芯片技术。
① PCR技术 又称为体外基因扩增技术,诞生于1985年,由美国PE-cetus公司Mullis等人发明,1987年得到美国专利局的专利授权。
PCR技术用于传染病的诊断主要是检测病原,做早期诊断和传染源的鉴定。它不仅可以检测活的病原体,而且还可检出已灭活的病原体,只要病原体的核酸未降解。因此,当由于各种原因无法进行病原分离与鉴定时(如人工方法不能培养或极端危险不宜培养),该技术将发挥巨大作用,既克服了技术难题,又安全可靠。它甚至能从存放多年的病理标本中检出某些病原体。传染病的病原体主要有真核生物、原核生物和非细胞型生物(病毒)三大类。每类病原体都有其特异性的核酸。检测出特异性核酸就能确定致病的微生物,从而确诊是那种传染病。
目前可以在因特网Gen bank中检索到大部分病原微生物的特异性核酸序列。PCR技术就是根据已知病原微生物特异性核酸序列,设计合成与其5′端同源、3′端互补的二条引物。在体外反应管中加入待检的病原微生物核酸(称为模板DNA)、引物、四种寡核苷酸(dNTP)和具有热稳定性的Taq DNA聚合酶,将反应试管置于自动化热循环仪(PCR仪)中,在适当条件下(Mg++离子,pH等)经过变性、复性、延伸三个步骤(三种不同的反应温度和时间)即为一个循环,一般进行20~30次循环后即可检测反应结果。如果引物上的碱基与待检病原微生物的核酸序列相匹配,合成的核酸产物就会以2n(n为循环次数)呈指数递增。产物经琼脂糖凝胶电泳,可见到预期大小的DNA条带出现,籍此可做出确切诊断。PCR技术具高度敏感性,可从106个细胞中检出一个被病毒感染的细胞。马立克氏病毒MDV感染鸡的第5天就可从血液中检出MDV病毒核酸。微量PCR的敏感性可达0.1Pg DNA量。PCR诊断方法具高度特异性,如用PCR方法可将MDV致瘤毒株与非致瘤毒株区分开来,这是一般诊断方法难以办到的。同时,PCR方法简便、快速,目前已广泛应用到几乎所有传染病的检测。另外,由PCR技术与其他技术相结合又衍生出一系列相关技术,如反转录PCR(RT-PCR)、免疫PCR、抗原捕获PCR、毛细管PCR、套式PCR(NestedPCR)、重组PCR、多重PCR等、实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)。
②核酸探针技术 核酸探针又称为基因探针或核酸分子杂交技术。该技术有三大组成部分:待检核酸(模板);固相载体(NC硝酸纤维膜或尼龙膜);用同位素、酶或荧光材料等标记的核酸探针。
根据反应特点核酸探针技术可分为原位杂交(直接在组织切片或细胞涂片上进行杂交反应)、斑点杂交(将待检的核酸或细胞裂解物,经过变性后直接点在固相膜上)、Southern杂交(将待检DNA,经内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳,变性后转到固相膜上)和northern杂交(方法与Southern杂交基本相同,但待检的是RNA)。探针材料可以是已知病原微生物的核酸片段、DNA或cDNA文库中核酸片段,或者根据已知病原微生物核酸序列,人工设计合成的特异寡核酸片段,总之探针核酸序列是已知的。将这些已知序列的核酸标记上同位素、地高辛、生物素等便制备成探针。模板核酸与探针经过变性、复性,根据碱基配对原则,如果模板核酸与探针核酸同源(互补)则二者结合并延伸扩增,否则不反应(与抗原抗体反应很类似)。利用酶底物反应或放射自显影方法,在固相膜的相应位置可见预期反应条带或斑点,从而做出准确诊断。该方法敏感性高,检测一个单基因仅需104拷贝,能检测出低至10-13g DNA,用单抗方法则至少需要107抗原分子;特异性强,可以从混合标本中正确鉴定出目的病原微生物,而且可从一个标本中同时检测几种核酸;简便快速,数小时即可出结果。
核酸探针诊断技术的应用范围:所有病原体的快速、准确诊断及分类鉴定;在混有大量杂菌或混合感染物中直接检出主要致病原,包括难以在体外培养的病原;检出隐性感染的动物;动物产品或食品的卫生检验。
③DNA芯片技术 DNA芯片又称为基因芯片(gene chip)、微阵列(microarray),属于生物芯片的一种。根据微阵列上探针不同,DNA芯片又分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。其技术和设备日趋成熟,在许多领域已有产品供应,例如筛选检测HIV病毒蛋白酶基因和反转录酶基因突变的DNA芯片,某些癌症基因的诊断芯片,大肠杆菌、酵母的蛋白表达谱芯片,金黄色葡萄球菌、白色念球菌DNA芯片等等。国外已有用于动物传染病诊断的报道,国内目前仍处于技术移植、探索和研究阶段。
DNA芯片技术是在核酸杂交、测序的基础上发展起来的,与Southern杂交、northern杂交同出一个原理,即DNA碱基配对和序列互补原理。该项技术应用成熟的照相平板印刷术和固相合成,在片基 (玻片、硅片、聚丙烯、尼龙膜等固相支持物)的精确部位合成千百万个高分辨率的不同化合物制成的探针。芯片上单个探针密度为107-108分子/片,并用荧光标记。待测核酸在芯片上与探针进行杂交,而不是传统的凝胶电泳后膜上杂交。通过共聚焦荧光显微镜进行激光扫描对杂交结果进行检测,荧光图象数据由计算机软件分析处理,做出快速诊断。DNA芯片技术可用于鉴定靶序列、基因突变检测、基因表达监控、新基因发现、遗传制图等。

